田樂 李德衛(wèi) 謝立信 周慶軍

1山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島眼科醫(yī)院，青島266071；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科研究所 山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，青島266071

糖尿病是一組由于胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病。持續(xù)的高血糖和長期代謝紊亂等可導(dǎo)致全身組織器官產(chǎn)生一系列的并發(fā)癥，包括眼、腎臟、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的損害及功能障礙。目前臨床上已發(fā)現(xiàn)多數(shù)糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)角膜功能不良，如反復(fù)發(fā)作的角膜潰瘍、持續(xù)角膜上皮缺損不愈合、角膜敏感度下降等。對(duì)嚴(yán)重角膜感染糖尿病患者的治療是臨床醫(yī)師面臨的非常棘手的問題。因此，探尋糖尿病角膜病變的具體發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床診斷和治療已成為廣大眼科工作者的又一重要研究課題。前期通過基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型小鼠角膜上皮分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子相對(duì)表達(dá)量較正常小鼠明顯下降。多項(xiàng)研究表明，Slit引導(dǎo)配體2(slit guidance ligand 2,Slit2)是多功能的單向神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子，作為Roundabout(Robo)的配體發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞和神經(jīng)再生的作用。但Slit2在糖尿病小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglions，TGs)中的表達(dá)情況有待驗(yàn)證。本研究擬通過在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察Slit2在糖尿病模型小鼠與正常小鼠角膜和TGs中的表達(dá)差異，探討Slit2對(duì)糖尿病小鼠角膜上皮和神經(jīng)的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)5～6周齡C57BL/6小鼠60只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司)，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)及使用均符合ARVO制定的科研動(dòng)物使用規(guī)范。本研究方案經(jīng)青島眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：[2020]57)。

1.1.2

小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系來源及處理 角膜上皮干/祖(TKE2)細(xì)胞系由廈門大學(xué)李煒教授贈(zèng)送。采用加入終質(zhì)量濃度為20～30 μg/ml牛垂體提取物(bovine pituitary extract，BPE)和終質(zhì)量濃度為0.1～0.2 ng/ml重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor，rEGF)的KSFM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)TKE2細(xì)胞，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長達(dá)70%～80%時(shí)，加入適量胰蛋白酶/EDTA，進(jìn)行1∶ 2細(xì)胞傳代，選取狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3

主要試劑及儀器 注射用鹽酸氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司)；氯丙嗪注射液(上海禾豐制藥有限公司)；兔抗鼠β-tubulin Ⅲ/FITC抗體(657403)(北京Biolegend公司)；兔抗鼠Slit2抗體(ab7665)、兔抗鼠表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗體(ab52894)、兔抗鼠p-EGFR抗體(ab40815)、兔抗鼠蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，AKT)抗體(ab38449)、兔抗鼠p-AKT抗體(ab179463)、兔抗鼠細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)(ab17942)、兔抗鼠p-ERK抗體(ab65142)、兔抗鼠β-catenin抗體(ab32572)、兔抗鼠Ki67抗體(ab16667)、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(ab150081)(英國Abcam公司)；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)(北京Solarbio公司)；胰蛋白酶、膠原酶(17101)(美國Gibco公司)；木瓜酶(3126)(美國Worthington公司)；總RNA提取試劑盒(德國Macherey-Nagel公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)。眼科手術(shù)器械(蘇州明仁醫(yī)療器械有限公司)；微量注射器(中國漢密爾頓公司)；眼科手術(shù)顯微鏡(德國Zeiss公司)；裂隙燈顯微鏡含照相系統(tǒng)(日本Topcon公司)；熒光顯微鏡(E800，日本Nikon公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Prism7500，美國ABI公司)；紫外分光光度計(jì)(NanoDrop One，美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組和Slit2注射組，每組20只。取糖尿病模型組和Slit2注射組小鼠采用鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)腹腔內(nèi)注射法建立糖尿病模型：所有小鼠均上午8：00禁食，當(dāng)天下午2：00按照50 mg/kg腹腔內(nèi)注射STZ(溶于pH 4.5的檸檬酸緩沖液)，注射完畢，加食加水，飲用水置換為糖水；第2天上午8：00禁食，同時(shí)置換普通飲水；按照以上方式重復(fù)3次，第6天上午飲水置換為普通飲水。分別于注射STZ后2 d、4周和8周檢測尾靜脈血糖，測定血糖值>300 mg/dl者為1型糖尿病模型建立成功。正常對(duì)照組予以等容量的檸檬酸緩沖液進(jìn)行注射。

1.2.2

小鼠角膜上皮損傷模型建立及上皮愈合情況 取正常對(duì)照組、糖尿病模型組小鼠于建模后即刻采用鹽酸氯丙嗪+鹽酸氯胺酮混合液0.4 ml腹膜下注射行全身麻醉，采用鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼行表面麻醉，點(diǎn)眼后5 min用直徑3 mm環(huán)鉆在小鼠雙眼角膜留下壓痕，手持電動(dòng)上皮刮刀沿壓痕刮除小鼠角膜中央上皮。均選取小鼠左眼為實(shí)驗(yàn)眼，右眼為對(duì)照眼。小鼠左眼角膜上皮刮除后立即結(jié)膜下注射50 μg/μl Slit2溶液4 μl作為Slit2注射組，右眼結(jié)膜下注射等容量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)作為糖尿病模型組。每組各取4只眼分別于注射后24 h、48 h和72 h結(jié)膜囊點(diǎn)熒光素鈉1滴，裂隙燈顯微鏡下觀察并照相，采用ImageJ圖像分析軟件測量各組角膜上皮缺損面積，角膜上皮缺損率=(熒光素染色面積/原始角膜上皮缺損面積)×100%，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定小鼠角膜上皮中Slit2及相關(guān)受體Robo1、Robo2、Robo3和Robo4的表達(dá) 取糖尿病模型建模成功后正常對(duì)照組和糖尿病模型組小鼠各4只，過量麻醉法處死，收集雙眼眼球組織作為1個(gè)樣本，置于20 nmol/L EDTA-PBS中，37 ℃條件下孵育1 h，分離角膜上皮組織置于EP管中。按照總RNA提取試劑盒步驟提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，目的基因?yàn)?p>Slit2

、

Robo1

、

Robo2

、

Robo3

和

Robo4

，以

GAPDH

作為內(nèi)參。

Slit2

正向引物為5’-GGCATGACAGGGAAATGTTGTA-3’，反向引物為5’-ACCACTGATGTCACGGAACTGT-3’；

Robo

1正向引物為5’-TGCAACAAATCCCATTTGAG-3’，反向引物為5’-GACACCCTGCATTGTTTGTTC-3’；

Robo

2正向引物為5’-GCTTAAAGGCAGTGCTCACA-3’，反向引物為5’-TCATTCAAAATGGGTCAAACA-3’；

Robo

3正向引物為5’-CTGATCAGACTCTTTTTATTG-3’，反向引物為5’-GAGAATATCATGAGTGCC-3’；

Robo

4正向引物為5’-GCGTCCTTTCCTTCAGTCTC-3’，反向引物為5’-GTCACACCATGCAAGGAAAC-3’；

GAPDH

正向引物為5’-CTGCCCAGAACATCATCCCT-3’，反向引物為5’-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAGA-3’。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)。采用2法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，取平均值，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4

角膜鋪片熒光染色法觀察角膜神經(jīng)形態(tài)和分布 小鼠角膜上皮損傷模型建立后第7天，糖尿病組和Slit2注射組各取2只小鼠雙眼眼球，分離角膜組織，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%多聚甲醛中固定，用20 nmol/L EDTA-PBS在37 ℃條件下孵育30 min，含體積分?jǐn)?shù)10%Triton的PBS透膜30 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白封閉1 h；置于β-tubulin Ⅲ/PE抗體(1∶ 200)，4 ℃條件下避光孵育過夜；DAPI染核，將角膜剪為4瓣，鋪片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5

免疫熒光染色法測定角膜上皮中Slit2信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá) 角膜上皮損傷模型建立后72 h，取正常對(duì)照組2只小鼠雙眼、糖尿病模型組4只小鼠右眼、Slit2注射組4只小鼠左眼眼球組織用冷凍膠包埋，常規(guī)8 μm厚連續(xù)冰凍切片，置載玻片上晾干30 min，滴加PBS至冷凍膠周圍以溶解冷凍膠，吸水紙吸凈PBS；4%多聚甲醛固定20 min,0.1%Triton X-100透化5 min；滴加5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，甩干；分別加入p-EGFR(1∶ 200)、p-ERK(1∶ 200)、p-AKT(1∶ 200)、β-catenin(1∶ 200)、Ki67(1∶ 250)和Slit2(1∶ 200)4 ℃濕盒孵育過夜；次日常溫下復(fù)溫1 h，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加熒光素標(biāo)記的二抗，室溫條件下濕盒避光孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min；DAPI染核，PBS沖洗，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6

Western blot法檢測TKE2細(xì)胞增生相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá) 將TKE2細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)70%～80%融合后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖組和Slit2干預(yù)組；正常對(duì)照組采用KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組和Slit2干預(yù)組均于含30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，Slit2干預(yù)組培養(yǎng)液中加入終質(zhì)量濃度為0.5 μg/ml的Slit2，于處理后10 min收集各組細(xì)胞。取于30 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d的TKE2細(xì)胞，加入終質(zhì)量濃度為0.5 μg/ml的Slit2，分別于處理前和處理后10、20、30、60、120 min收集細(xì)胞。另取高糖條件下培養(yǎng)的TKE2細(xì)胞分別加入終質(zhì)量濃度為0.01、0.1和0.5 μg/ml的Slit2，于處理后10 min收集細(xì)胞。取收集的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮匙收集細(xì)胞于EP管中超聲至均勻透明；95 ℃變性5 min，-20 ℃保存，BCA法測定蛋白濃度；取40 μg蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃環(huán)境下將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；將PVDF膜置于體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后，分別置于一抗p-EGFR(1∶ 1 000)、EGFR(1∶ 1 000)、p-AKT(1∶ 1 000)、AKT(1∶ 10 000)、p-ERK(1∶ 1 000)、ERK(1∶ 1 000)、β-catenin(1∶ 5 000)、GAPDH(1∶ 1 000)，室溫下孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min；加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h；加入顯色液于暗室顯影。將膠片放入凝膠成像系統(tǒng)中。拍照保存，用ImageJ軟件定量分析結(jié)果；以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7

TGs細(xì)胞原代培養(yǎng)及突觸長度測定 各組角膜上皮損傷模型建模第3天，每組各取2只小鼠，脊椎脫臼法處死小鼠，去除小鼠頭骨處皮膚，用虹膜剪剪掉頭骨暴露出腦組織并尋找TGs，用剪刀剪斷TGs的3個(gè)主要分支及其與腦的連接部分。夾住TGs后端，取出TGs；用彈簧剪將神經(jīng)節(jié)剪成10～12份，轉(zhuǎn)入含1.5 ml Hanks平衡鹽溶液的離心管中，加入木瓜酶于37 ℃條件下水浴20 min，低速離心(離心力<200×

g

)收集沉淀，加入膠原酶于37 ℃條件下水浴20 min，400×

g

離心收集沉淀，加入0.5 ml預(yù)熱的含5%胎牛血清、5%羥乙基哌嗪乙烷磺酸、5%青鏈霉素的L15完全培養(yǎng)基。制作12.5%+28% Percoll梯度分離液,輕輕將0.5 ml細(xì)胞懸液加到Percoll梯度分離液上，1 300×

g

離心10 min，棄去上層4.5 ml含界面處碎片的Percoll梯度分離液，加入4 ml L15完全培養(yǎng)基，1 000×

g

離心6 min，去除培養(yǎng)液，用600 μl L15完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞懸液至含玻片的培養(yǎng)孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，加入1 ml預(yù)熱的L15完全培養(yǎng)基，每3 d換液1次。待細(xì)胞至50%～60%融合時(shí)將培養(yǎng)液吸除，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗3次，0.1%Triton X-100透化5 min，牛血清白蛋白封閉液封閉20 min，吸除封閉液加入β-tubulin Ⅲ/FITC抗體(1∶ 200)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，DAPI染核3 min，PBS沖洗2次。熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用ImageJ圖像分析軟件測量神經(jīng)軸突長度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)W檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以表示。采用單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計(jì)，正常對(duì)照組和糖尿病模型組間評(píng)估指標(biāo)的差異比較采用獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)，正常對(duì)照組、糖尿病模型組和Slit2注射組間評(píng)估指標(biāo)總體差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-

t

檢驗(yàn)。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠角膜上皮損傷后不同時(shí)間點(diǎn)上皮愈合情況比較

各組小鼠角膜上皮損傷后角膜中央出現(xiàn)直徑3 mm上皮缺損，角膜上皮損傷后48 h，正常對(duì)照組、糖尿病模型組和Slit2注射組均可見角膜熒光素染色，糖尿病模型組角膜上皮熒光素染色面積明顯大于正常對(duì)照組和Slit2注射組；角膜上皮損傷后72 h，正常對(duì)照組和Slit2注射組角膜未見明顯熒光素染色，糖尿病模型組仍可見角膜中央熒光素染色(圖1)。各組間小鼠角膜缺損后48 h和72 h角膜上皮缺損率總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=406.684,

P

<0.01；

F

=25.708,

P

=0.007)；Slit2注射組小鼠角膜缺損后48 h和72 h角膜上皮缺損率均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)糖尿病模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(表1)。

圖1 各組小鼠角膜上皮損傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜熒光素染色圖 正常對(duì)照組和Slit2注射組造模后48 h角膜熒光素染色面積較造模后24 h明顯縮小，造模后72 h角膜未見熒光素染色；糖尿病模型組造模后48 h仍可見大面積角膜熒光素染色，造模后72 h可見角膜中央熒光素染色 Slit2：Slit引導(dǎo)配體2Figure 1 Corneal epithelial wound healing of rats in different groups at various time points In normal control group and Slit2 injection group,there was an obviously smaller area of fluorescein staining at 48 hours compared with 24 hours following modeling,and no fluorescein staining was found at 72 hours following modeling.In diabetes group,a large area of fluorescein staining was found at 48 hours following modeling,and fluorescein staining of the central cornea was observed at 72 hours following modeling Slit2:slit guidance ligand 2

2.2 正常對(duì)照組與糖尿病模型組小鼠角膜上皮中Slit2及相關(guān)受體mRNA表達(dá)比較

糖尿病模型組小鼠角膜上皮中Slit2、Robo1、Robo2和Robo4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(表2)。

表2 正常對(duì)照組與糖尿病模型組角膜上皮 Slit2及其受體mRNA表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of the mRNA expression levels of Slit2 and its receptors in corneal epithelium between two groups (x±s)組別樣本量Slit2Robo1Robo2Robo3Robo4正常對(duì)照組41.04±0.351.03±0.301.00±0.071.05±0.411.02+0.26糖尿病模型組42.80±1.432.68±0.633.29±0.650.87+0.041.48+0.22t值13.94416.76037.2750.55635.456P值0.0200.0200.0300.5400.030 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) Slit2:Slit引導(dǎo)配體2 Note:(Independent samples t-test) Slit2:slit guidance ligand 2

表1 各組小鼠角膜缺損后不同時(shí)間點(diǎn)角膜上皮缺損率比較(x±s,%)Table 1 Comparison of corneal epithelial defects at different time points among various groups (x±s,%)組別眼數(shù)48 h角膜上皮缺損率72 h角膜上皮缺損率正常對(duì)照組1210.52±5.14 a0.81±0.72 a糖尿病模型組1261.31±7.2126.38±6.25Slit2注射組1218.67±6.00a0.38±0.23aF值406.68425.708P值<0.010.007 注:與糖尿病模型組比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Slit2:Slit引導(dǎo)配體2 Note:Compared with diabetes group,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Slit2:slit guidance ligand 2

2.3 糖尿病模型組與Slit2注射組小鼠角膜神經(jīng)形態(tài)及分布比較

角膜鋪片熒光染色顯示，小鼠角膜上皮損傷模型建立后7 d，糖尿病模型組小鼠角膜神經(jīng)叢分布稀疏，神經(jīng)纖維數(shù)量減少，神經(jīng)纖維分支消失；Slit2注射組角膜神經(jīng)叢致密，神經(jīng)纖維數(shù)量多且分布均勻，神經(jīng)末梢可見較多分支，神經(jīng)纖維網(wǎng)連接緊密，走行正常(圖2)。

圖2 糖尿病模型組和Slit2注射組小鼠角膜神經(jīng)β-tubulin Ⅲ熒光染色圖(PE) A：各組角膜神經(jīng)叢分布比較(×40) 糖尿病模型組小鼠角膜神經(jīng)纖維叢稀疏，Slit2注射組角膜神經(jīng)叢致密 B：各組角膜神經(jīng)纖維形態(tài)(×200，標(biāo)尺=50 μm) 糖尿病模型組小鼠角膜神經(jīng)纖維稀疏，Slit2注射組角膜神經(jīng)纖維明顯較密集 Slit2：Slit引導(dǎo)配體2Figure 2 Immunofluorescence staining of β-tubulin Ⅲ of mouse nerve plexuses in diabetes group and Slit2 injection group (PE) A:Comparison of distribution of mouse nerve plexuses between two groups (×40) The mouse nerve plexuses were sparse in diabetes group and compact in Slit2 injection group B:Morphology of corneal nerve fibers of two groups (×200,bar=50 μm) There were few corneal nerve fibers scarcely distributed in diabetes group,and there were more densely distributed in Slit2 injection group Slit2:slit guidance ligand 2

2.4 正常對(duì)照組與糖尿病模型組角膜組織中Slit2表達(dá)分布比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Slit2在正常角膜上皮中呈陽性表達(dá)，正常對(duì)照組與糖尿病模型組正常角膜上皮中Slit2熒光強(qiáng)度無明顯差別(圖3A)；糖尿病模型組修復(fù)的角膜上皮中Slit2熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯減弱(圖3B)。

圖3 正常對(duì)照組與糖尿病模型組小鼠正常和損傷修復(fù)的角膜上皮中Slit2免疫熒光染色圖(×400,標(biāo)尺=100 μm) A：各組正常角膜上皮中均可見Slit2陽性表達(dá)，呈紅色熒光(PE)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI) B：正常對(duì)照組損傷修復(fù)的角膜上皮中可見Slit2陽性表達(dá)，呈綠色熒光(FITC)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI)，糖尿病模型組損傷修復(fù)的角膜上皮中Slit2熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組減弱 Slit2：Slit引導(dǎo)配體2Figure 3 Immunofluorescence staining of Slit2 in mouse retinas of different groups (×400,bar=100 μm) A:The red fluorescence of Slit2 (PE) and the blue fluorescence of nuclei (DAPI) were found in mouse corneal epithelia of both normal control group and diabetes group B:The green fluorescence of Slit2 (FITC) and the blue fluorescence of nuclei (DAPI) were observed in the regenerated corneal epithelia of normal control group.The fluorescence intensity of Slit2 observed in the regenerated corneal epithelia of diabetes group was weaker than normal control group Slit2:slit guidance ligand 2

2.5 各組小鼠損傷修復(fù)角膜上皮中Slit2信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)及分布比較

角膜上皮損傷模型建立后72 h，正常對(duì)照組和Slit2注射組角膜上皮中p-EGFR、p-ERK和β-catenin表達(dá)均呈強(qiáng)熒光，糖尿病模型組角膜上皮中p-EGFR、p-ERK、p-AKT和β-catenin表達(dá)熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖4)。

圖4 各組小鼠損傷修復(fù)后角膜上皮p-EGFR、p-ERK、p-AKT和β-catenin免疫熒光染色圖(×400，標(biāo)尺=100 μm) 角膜上皮損傷模型建立后72 h，正常對(duì)照組和Slit2注射組角膜上皮中p-EGFR、p-ERK、p-AKT和β-catenin表達(dá)呈中等熒光強(qiáng)度，其中Slit2注射組中p-ERK、p-EGFR和β-catenin熒光表達(dá)強(qiáng)度較正常對(duì)照組高，糖尿病模型組中p-EGFR、p-ERK、p-AKT和β-catenin熒光強(qiáng)度減弱 Slit2：Slit引導(dǎo)配體2；EGFR：表皮生長因子受體；ERK：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；AKT：蘇氨酸蛋白激酶；β-catenin：β連環(huán)蛋白Figure 4 Immunofluorescence staining of p-EGFR,p-ERK,p-AKT and β-catenin in regenerated mouse corneal epithelia of various groups (×400,bar=100 μm,) Seventy-two hours after corneal epithelial damage,moderate fluorescence of p-EGFR,p-ERK,p-AKT and β-catenin expression was found in normal control group and the Slit2 injection group,which was attenuated in diabetes group,and there was stronger fluorescence of p-EGFR,p-ERK and β-catenin in Slit2 injection group than normal control group Slit2:slit guidance ligand 2；EGFR:epidermal growth factor receptor；ERK:extracellular signal-regulated kinase；AKT:threonine protein kinase

2.6 各組小鼠損傷修復(fù)角膜上皮中Ki67的表達(dá)比較

角膜上皮損傷模型建立后72 h，正常對(duì)照組角膜上皮中Ki67呈強(qiáng)熒光，Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊；糖尿病模型組角膜上皮中Ki67熒光明顯減弱；與糖尿病模型組比較，Slit2注射組角膜上皮中Ki67熒光明顯增強(qiáng)，Ki67陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(圖5)。

圖5 各組小鼠損傷修復(fù)72 h角膜上皮Ki67熒光染色圖(×400，標(biāo)尺=100 μm) Ki67陽性細(xì)胞呈綠色熒光(FITC)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI)；與糖尿病模型組相比，正常對(duì)照組和Slit2注射組Ki67陽性角膜上皮細(xì)胞數(shù)量較多，Ki67熒光明顯增強(qiáng) Slit2：Slit引導(dǎo)配體2Figure 5 Immunofluorescence staining of Ki67 in regenerated mouse corneal epithelia of various groups at 72 hours after corneal epithelial damage (×400,bar=100 μm) Ki67-positive cells showed green fluorescence (FITC),and nuclei presented blue fluorescence (DAPI).There were more Ki67-positive cells and stronger fluorescence of Ki67 in normal control group and Slit2 injection group than diabetes group Slit2:slit guidance ligand 2

2.7 各組TKE2細(xì)胞各信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)計(jì)較

正常對(duì)照組、高糖組和Slit2干預(yù)組TKE2細(xì)胞中p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT和β-catenin相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=39.239、28.912、29.325，均

P

<0.05)，高糖組TKE2細(xì)胞內(nèi)p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT和β-catenin相對(duì)表達(dá)量均明顯低于正常對(duì)照組和Slit2干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖6)。

圖6 各組TKE2細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和β-catenin表達(dá)量比較 A：各組p-EGFR/EGFR相對(duì)表達(dá)量比較 F=39.239，P<0.05 B：各組p-AKT/AKT相對(duì)表達(dá)量比較 F=28.912，P<0.05 C：各組p-ERK/ERK相對(duì)表達(dá)量比較 F=0.048，P>0.05 D：各組β-catenin相對(duì)表達(dá)量比較 F=29.325，P<0.05 與高糖組比較，a P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) ERGR：表皮生長因子受體；Slit2：Slit引導(dǎo)配體2；AKT：蘇氨酸蛋白激酶；ERK：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；β-catenin：β-連環(huán)蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶Figure 6 Comparison of the expression levels of p-EGFR/EGFR,p-AKT/AKT,p-ERK/ERK and β-catenin in TKE2 cells among groups A:Comparison of p-EGFR/EGFR relative expression level F=39.239, P<0.05 B:Comparison of p-AKT/AKT relative expression level F=28.912,P<0.05 C:Comparison of p-ERK/ERK relative expression level F=0.048,P>0.05 D:Comparison of β-catenin relative expression level F=29.325,P<0.05 Compared with high glucose group,a P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) ERGR:epidermal growth factor receptor；Slit2:slit guidance ligand 2；AKT:threonine protein kinase；ERK:extracellular regulated protein kinases；GAPDH:glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase

高糖培養(yǎng)條件下TKE2細(xì)胞Slit2處理不同時(shí)間點(diǎn)p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=43.652、53.241,均

P

<0.05)；其中高糖培養(yǎng)條件下Slit2處理10 min時(shí)，p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的相對(duì)表達(dá)量較未處理時(shí)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)；Slit2處理30 min時(shí)p-EGFR/EGFR的相對(duì)表達(dá)量明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)，Slit2處理60 min時(shí)p-AKT/AKT的相對(duì)表達(dá)量明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖7)。

圖7 高糖培養(yǎng)條件下Slit2不同處理時(shí)間TKE2細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT表達(dá)量比較 A:Slit2不同處理時(shí)間點(diǎn)p-EGFR/EGFR表達(dá)比較 F=43.562,P<0.05.與處理后30 min比較，a P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) B:Slit2不同處理時(shí)間點(diǎn)p-AKT/AKT表達(dá)比較 F=53.241，P<0.05.與處理后60 min比較，a P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) Slit2：Slit引導(dǎo)配體2；TKE2：小鼠角膜上皮干/祖細(xì)胞系；ERGR：表皮生長因子受體；AKT：蘇氨酸蛋白激酶 圖8 高糖培養(yǎng)條件下不同質(zhì)量濃度Slit2處理TKE2細(xì)胞p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT表達(dá)量比較 A:不同質(zhì)量濃度Slit2處理TKE2細(xì)胞p-EGFR/EGFR表達(dá)比較 F=65.371,P<0.05.與0.01 μg/ml Slit2比較，a P<0.05；與0.1 μg/ml Slit2比較，b P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) B:不同質(zhì)量濃度Slit2處理TKE2細(xì)胞p-AKT/AKT表達(dá)比較 F=122.231,P<0.05.與0.01 μg/ml Slit2比較，a P<0.05；與0.1 μg/ml Slit2比較，b P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) 1:0.01 μg/ml Slit2；2:0.1μg/ml Slit2；3:0.5μg/ml Slit2 Slit2：Slit引導(dǎo)配體2；EGFR：表皮生長因子受體；AKT：蘇氨酸蛋白激酶Figure 7 Comparison of the expression levels of p-EGFR/EGFR and p-AKT/AKT in high glucose-cultured TKE2 cells after different treatment time of Slit2 A:Comparison of the relative expression levels of p-EGFR/EGFR F=43.562,P<0.05.Compared with the value after 30-minute treatment,a P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) B:Comparison of the relative expression levels of p-AKT/AKT F=53.241,P<0.05.Compared with the value after 60-minute treatment,a P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) Slit2:slit guidance ligand 2；TKE2:mouse corneal epithelial stem/progenitor cell line；EGFR:epidermal growth factor receptor；AKT:threonine protein kinase Figure 8 Comparison of the expression levels of p-EGFR/EGFR and p-AKT/AKT in high glucose-cultured TKE2 cells treated with different concentrations of Slit2 A:Comparison of the relative expression levels of p-EGFR/EGFR F=65.371,P<0.05.Compared with 0.01 μg/ml Slit2,a P<0.05；compared with 0.1 μg/ml Slit2,b P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) B:Comparison of the relative expression levels of p-AKT/AKT F=122.231,P<0.05.Compared with 0.01 μg/ml Slit2,a P<0.05；compared with 0.1 μg/ml Slit2,b P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=3) 1；0.01 μg/ml Slit2；2；0.1μg/ml Slit2；3；0.5μg/ml Slit2 Slit2:slit guidance ligand 2；EGFR:epidermal growth factor receptor；AKT:threonine protein kinase

高糖培養(yǎng)條件下，隨著Slit2質(zhì)量濃度的增加，p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，不同質(zhì)量濃度Slit2處理細(xì)胞的p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=65.371、122.231，均

P

<0.05)(圖8)。

2.8 各組原代培養(yǎng)的TGs突觸長度比較

正常對(duì)照組、糖尿病模型組和Slit2注射組原代培養(yǎng)的TGs突觸長度分別為(72.14±9.48)、(40.52±5.44)和(73.04±4.66)μm，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=83.674，

P

<0.01),其中糖尿病模型組TGs突觸長度明顯短于正常對(duì)照組和Slit2注射組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖9)。

圖9 各組原代培養(yǎng)TGs突觸長度比較 A：各組原代培養(yǎng)TGs的β-tubulin Ⅲ免疫熒光圖(FITC ×400，標(biāo)尺=100 μm) B：各組原代培養(yǎng)TGs突觸長度量化比較 F=83.674，P<0.01.與糖尿病模型組比較，a P<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=10) TGs：三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;Slit2：Slit引導(dǎo)配體2Figure 9 Comparison of synapse length of primary cultured TGs among different groups A:Immunofluorescence image of β-tubulin Ⅲ of primary cultured TGs in normal control group,high glucose group and high glucose+Slit2 treatment group (FITC ×400,bar=100 μm) B:Quantitative comparison of synaptic length of primary cultured TGs among three groups F=83.674,P<0.01.Compared with diabetes model group,a P<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=10) Slit2:slit guidance ligand 2;TGs:trigeminal ganglion cells

3 討論

糖尿病角膜病變由Schultz等提出并命名，主要表現(xiàn)為角膜上皮再生延遲、角膜敏感性下降、神經(jīng)營養(yǎng)性角膜潰瘍等；如果沒有得到及時(shí)有效的干預(yù)治療，其有致盲的危險(xiǎn)。高血糖對(duì)角膜各層結(jié)構(gòu)均會(huì)產(chǎn)生影響，其中對(duì)淚膜、角膜上皮和神經(jīng)的影響較為明顯。目前，大量研究結(jié)果表明晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是引起糖尿病慢性并發(fā)癥的重要因素之一，表現(xiàn)為AGEs的異常蓄積導(dǎo)致角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞功能受損，進(jìn)而影響角膜的損傷修復(fù)。有研究已證明AGEs是引起糖尿病周圍神經(jīng)病變的因素之一，但其對(duì)糖尿病角膜神經(jīng)病變的影響尚缺少相關(guān)報(bào)道。

Slit

基因于1984年在果蠅中首次被發(fā)現(xiàn)，其在人體多處組織中均有表達(dá)，包括眼、心臟、腦、血管等。Slit的主要功能包括影響神經(jīng)軸突生長方向、引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞遷移、影響神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)分化、血管形成、心臟形態(tài)發(fā)生改變和腫瘤細(xì)胞遷移等。迄今在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)3種

Slit

(1、2、3)和4種

Robo

配體(1、2、3、4)基因。

關(guān)于Slit2在眼組織中的研究報(bào)道不多，多集中于探討Slit2在視網(wǎng)膜組織中的神經(jīng)軸突導(dǎo)向作用以及參與視網(wǎng)膜新生血管的形成。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，Slit-Robo參與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變中視網(wǎng)膜纖維血管膜的形成。Han等的研究發(fā)現(xiàn)Slit2具有抗角膜新生血管作用。本研究中，免疫熒光染色結(jié)果顯示Slit2在正常對(duì)照組和糖尿病模型組角膜上皮中均有表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示Slit2及其受體Robo1、Robo2、Robo3、Robo4在糖尿病小鼠中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在角膜上皮損傷修復(fù)后第3天，免疫熒光顯示糖尿病模型小鼠角膜上皮中Slit2熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯降低，Slit2注射組p-EGFR、p-ERK、β-catenin和Ki67熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯升高。猜測Slit2及其受體在糖尿病模型小鼠角膜上皮中可能處于一種代償狀態(tài)，在角膜上皮損傷修復(fù)的早期維持角膜上皮的穩(wěn)定性。

糖尿病對(duì)于角膜上皮修復(fù)的影響表現(xiàn)為角膜上皮屏障功能受損，角膜上皮損傷愈合延遲，引發(fā)反復(fù)的上皮糜爛，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致角膜感染的發(fā)生，同時(shí)還可引起角膜炎性細(xì)胞增加、內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及密度改變、干眼等。已有研究證實(shí)糖尿病導(dǎo)致角膜上皮中生長因子的表達(dá)量下降。為進(jìn)一步證實(shí)Slit2對(duì)于角膜上皮的保護(hù)作用，本研究建立小鼠角膜上皮損傷修復(fù)模型，造模72 h后角膜熒光素染色發(fā)現(xiàn)Slit2結(jié)膜下注射可以促進(jìn)糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復(fù)。本研究結(jié)果表明，Slit2廣泛表達(dá)于角膜上皮，并在STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠上皮損傷修復(fù)的早期表達(dá)顯著降低，結(jié)膜下注射外源性Slit2可促進(jìn)角膜上皮修復(fù)，發(fā)揮上皮保護(hù)作用。

研究已證實(shí)Slit2發(fā)揮作用的細(xì)胞通路包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、β-catenin、ERK、Akt、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF)-κB、Notch等，大多是在研究Slit2的促癌和抑癌作用中發(fā)現(xiàn)的。Slit2通過VEGF促進(jìn)血管生成，如增強(qiáng)視網(wǎng)膜的新生血管化、增加人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，在增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中Slit2和VEGF的表達(dá)均升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Slit2可激活糖尿病模型小鼠角膜上皮損傷修復(fù)過程中ERK、EGFR和β-catenin信號(hào)通路，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也表明其可激活EGFR、AKT和β-catenin信號(hào)通路，而Slit2對(duì)EGFR的激活作用最為明顯。Slit2的最適作用質(zhì)量濃度為0.5 μg/ml，高糖培養(yǎng)條件下0.5 μg/ml Slit2處理TKE2細(xì)胞10 min即對(duì)EGFR通路產(chǎn)生激活作用，處理30 min時(shí)作用達(dá)頂峰，故猜測Slit2在糖尿病模型小鼠中主要通過激活EGFR信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)角膜上皮的作用。

糖尿病對(duì)于角膜神經(jīng)的影響表現(xiàn)為角膜敏感性下降，神經(jīng)密度降低、分支減少，即使血糖控制良好，也不能完全扭轉(zhuǎn)角膜神經(jīng)病變，糖尿病患者角膜神經(jīng)的病變程度與外周神經(jīng)損傷程度相關(guān)。本研究中角膜神經(jīng)染色結(jié)果顯示，角膜上皮損傷修復(fù)后7 d Slit2結(jié)膜下注射可以促進(jìn)糖尿病模型鼠角膜上皮下神經(jīng)損傷的修復(fù)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Slit2可以促進(jìn)高糖環(huán)境下TGs突觸生長，表明Slit2可在高糖環(huán)境下發(fā)揮角膜上皮下神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，本研究通過體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和在體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Slit2可促進(jìn)糖尿病模型小鼠角膜上皮和神經(jīng)損傷修復(fù)，其可能主要通過激活EGFR信號(hào)通路來發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)仍存在一定局限性，如未對(duì)在體角膜進(jìn)行定量分析，僅肉眼分辨熒光強(qiáng)度，下一步應(yīng)結(jié)合相關(guān)受體進(jìn)行探討。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)角膜上皮損傷修復(fù)早期的研究，對(duì)于角膜上皮損傷修復(fù)后何時(shí)Slit2的表達(dá)可以達(dá)到未損傷水平還將繼續(xù)探討。另外需對(duì)Slit2在糖尿病角膜神經(jīng)病變中發(fā)揮作用的具體機(jī)制進(jìn)一步探索。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

田樂：參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集和分析/解釋，論文撰寫和統(tǒng)計(jì)分析；李德衛(wèi)：參與數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析/解釋及統(tǒng)計(jì)分析；謝立信、周慶軍：參與選題、研究設(shè)計(jì)、論文智力性內(nèi)容的修改和審核、最終定稿