賈紹華，金詩鵬，孫萌遙，丁海鑫，楊 波，葉 超

（哈爾濱商業(yè)大學 藥學院（藥物工程技術研究中心），黑龍江 哈爾濱 150076）

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是胚胎發(fā)育、細胞纖維化及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要環(huán)節(jié)[1]。在EMT過程中，下調(diào)E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和過量表達間波形蛋白（vimentin）能導致細胞之間的黏附性降低，細胞的運動能力增強，同時為侵襲提供了必要條件。藥物可通過調(diào)節(jié)多種信號通路抑制EMT過程，進一步影響腫瘤的遷移和侵襲，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。芒柄花素（formononetin，F(xiàn)MN）是從黃芪、甘草、葛根的根中分離出的異黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、解痙攣等多種藥理活性[2-3]。據(jù)報道，芒柄花素可抑制卵巢癌、結直腸癌、鼻咽癌等多種腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，其抗腫瘤作用可能與調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）信號通路有關[4-6]。本文以腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程EMT為切入點，在確定芒柄花素對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移、黏附和侵襲能力有抑制作用的基礎上，研究芒柄花素對EMT過程中E-cadherin和vimentin，以及轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路的TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白激酶2/9（MMP-2/9）及MAPK信號通路的磷酸化細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）、磷酸化p38蛋白（pp38）表達的影響，揭示芒柄花素抑制腫瘤遷移和侵襲的作用機制，為更好地開發(fā)和利用芒柄花素抗腫瘤作用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ECO-170P-230 CO2培養(yǎng)箱（美國NBS公司）；iMark酶標儀（美國Bio-Rad公司）；CKX-41-32型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Image Quant LAS 500凝膠成像系統(tǒng)（美國GE公司）。

1.2 藥品與試劑

芒柄花素（批號：MUST-20041602，質(zhì)量分數(shù)＞99.03 %，成都曼思特）；胎牛血清（批號：1910050，浙江天杭）；RPMI 1640溶液（批號：MA0215），CCK-8（批號：MA0218-5-aprolf，大連美侖）；牛血清白蛋白（BSA，批號：EZ2811E172，廣州賽國）；纖連蛋白（FN，批號：F8180，北京索寶來）；RIPA裂解液（批號：P0013C，碧云天）；Matrigel（批號：0097011，美國BD公司）；鹽酸表阿霉素（批號：17110102，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司）；鼠抗GAPDH抗體，鼠抗E-cadherin抗體，鼠抗p38抗體，鼠抗p-p38抗體（碧云天）；兔抗MMP-2抗體，兔抗MMP-9抗體，兔抗TGF-β1抗體（博奧森）；鼠抗vimentin抗體，鼠抗ERK抗體，鼠抗p-ERK抗體（沈陽萬類）。

1.3 細胞株

人乳腺癌MCF-7細胞株，由哈爾濱商業(yè)大學藥學院（藥物工程技術研究中心）提供。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測芒柄花素對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度至3×104個細胞/ml，按每孔200 μl接種于96孔板中，放入37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，給藥組分別加入濃度為6，12，24，48，96 μmol/L的芒柄花素。陽性對照組加鹽酸表阿霉素，陰性對照組加入等量的空白培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)2 d。各組均設置6個重復組。48 h后，向每個孔中加入CCK-8。反應3 h后，計算細胞生長抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。抑制率（%）=[（對照孔吸光度-試驗孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）]×100。

2.2 細胞劃痕實驗檢測芒柄花素對人乳腺癌MCF-7細胞遷移能力的影響

取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞并調(diào)節(jié)細胞密度至6×105個細胞/ml，取1.6 ml細胞懸液接種于6孔板中，混勻，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出6孔板，顯微鏡下觀察，待細胞完全貼壁后在單層細胞上劃痕致傷，吸出培養(yǎng)液，每孔用PBS清洗2次。分為5組，陽性對照組各孔加鹽酸表阿霉素溶液1.6 ml，使其終濃度為0.50 μmol/L，陰性對照組加空白培養(yǎng)液1.6 ml，實驗組各孔分別加芒柄花素溶液1.6 ml，使其終濃度為18.75，37.50，75.00 μmol/l，拍照記錄后移入培養(yǎng)箱，24 h后取出6孔板再次拍照，計算傷口愈合率。傷口愈合率（%）=（遷移前劃痕面積-遷移后劃痕面積）/遷移前劃痕面積×100。

2.3 細胞黏附實驗檢測芒柄花素對人乳腺癌MCF-7細胞黏附能力的影響

調(diào)整細胞密度為2.5×105個細胞/ml，取1.6 ml細胞懸液接種于6孔板中，放入37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，陽性對照組各孔加鹽酸表阿霉素溶液1.6 ml，使其終濃度為0.50 μmol/L，陰性對照組加空白培養(yǎng)液1.6 ml，實驗組各孔分別加芒柄花素溶液1.6 ml，使其終濃度為18.75，37.50，75.00 μmol/L。稀釋Matrigel膠，將稀釋后的Matrigel膠鋪在96孔板里，每孔35 μl。置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱24 h。取出6孔板，胰蛋白酶消化后離心，除去含血清的培養(yǎng)基，用RP1640溶液稀釋，將細胞密度調(diào)整為2.5×105個細胞/ml。取96孔板，用2 % BSA封閉30 min，按每孔150 μl接種于96孔板中，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，取出，用PBS輕輕洗一次，加入噻唑藍（MTT），4 h后每孔加入DMSO，測OD值，計算黏附率。黏附率（%）=實驗組吸光度/對照組吸光度×100。

2.4 細胞侵襲實驗檢測芒柄花素對人乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的影響

調(diào)整細胞密度為2.5×105個細胞/ml，取1.6 ml細胞懸液接種于6孔板中，放入37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，陽性對照組各孔加鹽酸表阿霉素溶液1.6 ml，使其終濃度為0.50 μmol/L，陰性對照組加空白培養(yǎng)液1.6 ml，實驗組各孔分別加芒柄花素溶液1.6 ml，使其終濃度為18.75，37.50，75.00 μmol/L。Matrigel膠用無酚紅RPMI1640按1:6稀釋，然后鋪在Tranwell上室，每孔60 μl。置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Tranwell小 室，將配制好的FN均勻涂在小室下室，置于超凈臺中干燥30 min，再在下室加入0.1 %BSA 200 μl，置培養(yǎng)箱孵育30 min。取出6孔板，加胰蛋白酶消化細胞，1500 r/min離心5 min，除去含血清的培養(yǎng)基，用無酚紅RP1640稀釋，將細胞調(diào)整為2.5×105個細胞/ml，從培養(yǎng)箱中取出Transwell小室并置于超凈臺中，向下室加入含10 %胎牛血清的培養(yǎng)基，上室吸去培養(yǎng)基，并加入細胞懸浮液200 μl，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中24 h。最后，棄去上室細胞液，將上室、下室的細胞固定染色，取棉簽將上室未侵襲過去的細胞擦去，顯微鏡下觀察、拍照，計算侵襲率。侵襲率（%）=實驗組的細胞數(shù)/對照組細胞數(shù)×100。

2.5 Western Blot檢測芒柄花素對TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白表達的影響

收集經(jīng)18.75 μmol/L、37.50 μmol/L和75.00 μmol/L芒柄花素作用48 h后的MCF-7細胞，經(jīng)RIPA裂解液法提取細胞總蛋白。檢測TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白的表達量變化，以β-actin為內(nèi)參，12 %聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（NC）膜上，室溫下脫脂奶粉封閉2 h，加入相應的一抗抗體，4 ℃孵育過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h。洗滌后增強型化學發(fā)光（ECL）顯色，Image Quant LAS 500凝膠成像儀分析。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，各組實驗數(shù)據(jù)均值采用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析比較均值，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 芒柄花素對MCF-7細胞增殖的影響

與對照組比較，隨芒柄花素給藥濃度的上升，對細胞增殖的抑制率逐漸增加，說明不同劑量的芒柄花素處理MCF-7細胞48 h，對MCF-7細胞的增殖有較好的抑制作用，且作用呈劑量依賴性。芒柄花素的IC50值為（74.61±0.03）μmol/L，根據(jù)IC50值確定后期給藥濃度分別為18.75，37.50，75.00 μmol/L。見表1。

表1 芒柄花素對MCF-7細胞增殖的影響（n=6）

3.2 芒柄花素對MCF-7細胞遷移能力的影響

細胞遷移實驗結果表明，不同濃度的芒柄花素處理MCF-7細胞48 h后，與陰性對照組比較，細胞遷移面積隨芒柄花素給藥劑量的增加而降低，各組的遷移率分別為：陰性對照組63.987 %±0.019 %，陽性對照組29.490 %±0.004 %，芒柄花素低劑量組56.537 %±0.008 %，中劑量組29.253 %±0.004 %，高劑量組14.880 %±0.001 %，芒柄花素各劑量給藥組的MCF-7細胞遷移能力顯著下降（P＜0.01），且作用呈劑量依賴性，提示芒柄花素具有抑制MCF-7細胞遷移的作用。見圖1。

圖1 芒柄花素對MCF-7細胞遷移的影響（4×10）

3.3 芒柄花素對MCF-7細胞黏附能力的影響

細胞黏附實驗結果表明，不同濃度的芒柄花素處理MCF-7細胞48 h后，與陰性對照組相比，細胞黏附率隨給藥劑量的增加而下降，各組的黏附率分別為：陽性對照組60.251 %±0.054 %、芒柄花素低劑量組99.320 %±0.130 %、中劑量組59.370 %±0.118 %、高劑量組34.443 %±0.038 %。芒柄花素中劑量和高劑量給藥組的MCF-7細胞黏附能力顯著下降（P＜0.01），且作用呈劑量依賴性，提示芒柄花素具有抑制MCF-7細胞黏附的作用。見表2。

表2 芒柄花素對人乳腺癌MCF-7細胞黏附能力的影響（n=3）

3.4 芒柄花素對MCF-7細胞侵襲能力的影響

細胞侵襲實驗的結果表明，不同濃度的芒柄花素處理MCF-7細胞48 h后，各組的侵襲率分別為：陽性對照組21.250 %±0.007 %，芒柄花素低劑量組47.458 %±0.006 %，中劑量組35.156 %±0.017 %，高劑量組14.881 %±0.001 %，細胞侵襲率隨芒柄花素給藥濃度的上升而下降（P＜0.01），且作用呈劑量依賴性，提示芒柄花素有抑制MCF-7細胞侵襲的作用。見圖2。

圖2 芒柄花素對MCF-7細胞遷移能力的影響（10×10）

3.5 芒柄花素對MCF-7細胞TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白表達的影響

Western Blot結果表明，與對照組相比，隨著芒柄花素給藥劑量的增加，E-cadherin蛋白的表達量顯著上升，TGF-β1、vimentin、MMP-2、MMP-9、p-p38、p-ERK蛋白表達量下降，表明芒柄花素可上調(diào)E-cadherin蛋白表達，下調(diào)vimentin蛋白及TGF-β信號通路的TGF-β1、MMP-2、MMP-9表達和MAPK信號通路的p-ERK1/2、p-p38的表達水平，提示芒柄花素可能通過影響EMT相關蛋白的表達抑制MCF-7細胞的侵襲、遷移和黏附能力。見圖3。

圖3 芒柄花素對MCF-7細胞TGF-β1、E-cadherin、vimentin、MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-p38蛋白表達的影響

4 討論

E-cadherin是鈣黏素家族中一個重要的細胞黏附因子，正常情況下E-cadherin的細胞質(zhì)區(qū)結構域與一些鏈蛋白結合，這些鏈蛋白可連E-cadherin和肌動蛋白的骨架，當這些鏈蛋白發(fā)生突變或缺失的時候，就會導致其黏附性下降，進而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，因此E-cadherin被認為是一種“侵襲抑制因子”[7]。Vimentin是細胞間絲蛋白家族成員，能構成細胞骨架，還被認為是EMT過程中的重要組成部分，vimentin表達的上調(diào)也與腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移關系密切[8]。TGF-β是一種與惡性腫瘤相關的細胞因子，在腫瘤發(fā)生的早期TGF-β能誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，但在晚期階段能促進EMT進程，促進腫瘤遷移、黏附和侵襲[9]。本研究結果顯示，隨著芒柄花素給藥劑量的上升，E-cadherin的表達升高，vimentin、TGF-β的表達降低，提示芒柄花素對人乳腺癌MCF-7的轉(zhuǎn)移和侵襲有抑制作用。

癌細胞轉(zhuǎn)移過程中的一個重要步驟是通過蛋白酶，如MMP對細胞外基質(zhì)（ECM）的降解。MMP是一個含鋅內(nèi)肽酶家族，其中MMP-2和MMP-9在侵襲性乳腺癌中高表達，并與臨床預后較差有關，抑制MMP-2和MMP-9的表達是預防腫瘤轉(zhuǎn)移的關鍵步驟[10]。本研究結果表明，芒柄花素可呈劑量依賴性降低MMP-2和MMP-9蛋白的表達，提示芒柄花素可通過降低MMP-2和MMP-9的表達來抑制MCF-7細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

MAPK通路是腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲信號轉(zhuǎn)導途徑中研究最多的激酶通路，其中p38通路、ERK通路是兩條重要的通路[11-12]，且MAPK通路中內(nèi)源性p38的活性與乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關。ERK1/2是腫瘤形成的一個重要蛋白，p-ERK1/2參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[13-14]。p-ERK1/2異常活化與乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲有關，其可能通過促進血管生成及降解基底膜發(fā)揮促進乳腺癌進展的作用。本研究結果顯示，芒柄花素可通過抑制MAPK信號通路的p-ERK1/2、p-p38的表達，協(xié)同抑制腫瘤的遷移、黏附和侵襲。

綜上，芒柄花素可通過抑制EMT過程及TGF-β通路和MAPK通路中相關蛋白的表達來抑制人乳腺癌MCF-7細胞的遷移、侵襲過程，但其作用機制尚不清晰，仍需進一步的深入研究。