晏濤，牛錚，張依琳，闞子斐，張靜怡，張淑娟，徐莎莎，鄒紅，雷程紅，宋振輝

1.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，烏魯木齊 830052； 2.西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 榮昌 402460

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diahorrea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起豬的一種急性高度接觸性腸道傳染病[1-3]．臨床癥狀以嘔吐、嚴重水樣腹瀉和脫水為主要特征[3-5]．2010年底，我國大面積暴發(fā)PED疫情，導致豬群高發(fā)病率及高死亡率，感染仔豬的致死率高達100%，造成巨大的經(jīng)濟損失[6-7]．在2013年，美國PED疫情不斷出現(xiàn)和廣泛流行，給美國養(yǎng)豬業(yè)造成沉痛打擊[8-9]．此外，國際貿(mào)易日益頻繁加劇了PEDV的全球暴發(fā)，也給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了威脅．

Na+/H+交換器3 (Na+/H+exchanger 3，NHE3)屬于SLC9A家族，存在于腸和腎上皮中，主要負責Na+的電中性吸收[10]．在正常生理情況下，NHE3介導腸腔內(nèi)Na+與腸上皮細胞內(nèi)H+的交換，促進腸道對Na+的吸收，進而形成滲透梯度，增加腸道對水的被動吸收[11-13]，并在鹽與液體的吸收和pH穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[14-15]．研究表明，NHE3-/-小鼠的腸道和腎臟存在吸收缺陷，并出現(xiàn)酸堿失衡和Na+溶液量紊亂[15-17]，當致瀉物質(zhì)如病毒、細菌和一些腸毒素作用于腸上皮細胞時，腸上皮細胞上相關(guān)離子通道及轉(zhuǎn)運載體的表達和活性就會發(fā)生異常改變，導致水和電解質(zhì)(Na+)的吸收和分泌受到干擾，從而引發(fā)腹瀉[18]．

在本研究中，我們利用PEDV感染IPEC-J2細胞后，檢測NHE3的活性及其蛋白表達情況，探究NHE3與PEDV感染之間的聯(lián)系，以期為PEDV感染誘發(fā)腹瀉機制研究奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

非洲綠猴腎細胞(VERO)，武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心； IPEC-J2細胞，上海素爾生物技術(shù)有限公司； PEDV CV777株由西南大學傳染病實驗室前期保存； DMEM 培養(yǎng)基，青鏈霉素，Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司； 澳洲胎牛血清，上海素爾科技有限公司； NHE3的siRNA干擾片段，廣東瑞博生物科技有限公司； 轉(zhuǎn)染試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司； 質(zhì)粒提取試劑盒，上海賽默飛世爾科技有限公司； pEGFP-N3，pEGFP-N3-NHE3是由該實驗室前期保存； RIPA細胞裂解液和BCA檢測蛋白濃度，上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 蛋白酶抑制劑，Sulfo-NHS-SS-Biotin，APExBIO公司； 鼠抗NHE3多克隆抗體，武漢金開瑞生物工程有限公司； 兔抗β-tubulin多克隆抗體，羊抗鼠 HRP偶聯(lián)IgG，羊抗兔HRP偶聯(lián)IgG，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 PEDV感染IPEC-J2細胞

將IPEC-J2細胞以每孔1×105細胞密度接種于12孔板中，直至細胞融合度達到約90%．棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次，每孔加入PEDV病毒液(感染復數(shù)0.1) 300 μL．每組設(shè)3個重復，培養(yǎng)2 h后棄去病毒液，然后每孔加入500 μL新鮮的完全培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)2 h，10 h，22 h，顯微鏡下觀察感染期間細胞的病理變化．

1.2.2 細胞內(nèi)外Na+測定

應用火焰原子吸收法測定IPEC-J2細胞中PEDV感染后細胞內(nèi)外液中Na+質(zhì)量濃度的變化情況[19]．將IPEC-J2細胞以每孔2.5×105細胞密度接種于24孔板中，分別設(shè)立0 h，24 h，48 h和72 h過表達NHE3組、干擾NHE3組、PEDV感染組．每組設(shè)置3個重復，同時設(shè)立3組平行時間對照組．當細胞生長至融合度約90%時，接種PEDV病毒液(感染復數(shù)0.1)，分別采集不同時間點的細胞內(nèi)外液，于-20 ℃保存； 按儀器和電腦軟件的操作說明，依次打開乙炔氣閥、儀器和電腦軟件，選擇Na元素燈，并在電腦軟件上設(shè)置參數(shù)：測量Na的工作波長選擇為 589 nm，工作負壓為 297 V，2 mA燈電流和1 200 mL/min的燃氣流量，然后尋峰； 待選擇峰值出現(xiàn)后，進行能量平衡； 待能量值到達100%時，進行零校； 然后點火成功后先用ddH2O清洗，再用5% KNO3介質(zhì)溶液進行潤洗； 最后進行各個樣品測量(包括質(zhì)量濃度分別為0.05 μg/mL，0.10 μg/mL，0.20 μg/mL，0.30 μg/mL，0.40 μg/mL的標準Na溶液稀釋液)，待樣品測量數(shù)值平穩(wěn)后，記錄該數(shù)值(該數(shù)值為儀器自動3次檢測數(shù)值的平均值)并處理數(shù)據(jù)； 用GraphPad Prism軟件繪制標準曲線和PEDV感染各個時間點下細胞內(nèi)外液中Na+的質(zhì)量濃度變化．

1.2.3 生物?；瘶擞洔y定膜蛋白

利用生物素酰化法檢測NHE3在IPEC-J2細胞膜上的表達量[20-21]．細胞用預冷PBS(150 mmol/L NaCl和20 mmol/L Na2HPO4，pH值為7.4)洗滌后，用1 mg/mL Sulfo-NHS-SS-Biotin室溫孵育30 min．然后用含有15 mmol/L甘氨酸的淬滅緩沖液洗滌以清除游離生物素．甘氨酸重懸后，2 184 r/min離心10 min，將細胞沉淀物在RIPA(含有100 mmol/L蛋白酶抑制劑)細胞裂解液中冰上裂解1 h，用Pierce BCA測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度，并用部分上清液分析總蛋白含量．根據(jù)蛋白濃度(1mL鏈霉親和素瓊脂糖可與6 mg蛋白結(jié)合)計算鏈霉親和素瓊脂糖的量，在4 ℃反應90 min，然后用含100 mmol/L蛋白酶抑制劑的RIPA洗滌3次，2 991 r/min離心30 s，除去游離蛋白．然后，加入6×protein loading buffer，在100 ℃變性10 min．Western blot分析IPEC-J2細胞膜上NHE3蛋白表達量的百分比．利用維爾伯融合FX5成像系統(tǒng)(VILBER)獲得印跡圖像，并分析各波段的灰度值．

1.2.4 Western blot檢測NHE3總蛋白的表達

使用RIPA裂解緩沖液從細胞中提取總蛋白，并使用BCA蛋白試劑盒確定蛋白濃度．蛋白通過10% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上．利用5%脫脂奶粉進行封閉，隨后用鼠抗NHE3多克隆抗體和兔抗β-tubulin多克隆抗體進行孵育，最后用羊抗鼠HRP偶聯(lián)IgG、羊抗兔HRP偶聯(lián)IgG作為二級抗體的抗體．利用維爾伯融合FX5成像系統(tǒng)(VILBER)獲得印跡圖像，并分析各波段的灰度值．

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV感染模型的建立

在顯微鏡下觀察PEDV感染細胞的病理變化(圖1)．正常的IPEC-J2細胞呈完整的梭形，邊界清晰，無重疊； PEDV感染4 h后無明顯變化； 12 h后細胞出現(xiàn)皺縮、伸長、融合，表現(xiàn)為典型的細胞病變； 24 h后，細胞形態(tài)嚴重受損，細胞皺縮成顆粒狀，部分細胞壞死．

圖1 PEDV感染IPEC-J2細胞4，12，24 h的病變

2.2 NHE3目標蛋白的最佳siRNA干擾片段的篩選

在IPEC-J2細胞中轉(zhuǎn)染3個針對NHE3的特異性siRNAs干擾片段，以篩選高效siRNA質(zhì)粒干擾片段，結(jié)果如圖2．在IPEC-J2細胞中，用微管蛋白(β-Tubulin)為內(nèi)參，NHE3的最佳干擾片段是siRNA-1，篩選出來的最佳干擾片段用于后續(xù)實驗．

圖2 IPEC-J2細胞中目的蛋白NHE3的最佳siRNA干擾片段篩選結(jié)果

2.3 PEDV感染細胞后對Na+交換活性的影響

火焰原子吸收法結(jié)果顯示，過表達NHE3組(pEGFP-NHE3+PEDV)、干擾NHE3組(siRNA1+PEDV)、PEDV感染組細胞內(nèi)Na+質(zhì)量濃度隨著感染時間的延長逐漸減低(圖3a)．在感染后的0 h和24 h時過表達NHE3組和干擾NHE3組相比，干擾NHE3組細胞內(nèi)Na+質(zhì)量濃度下降比較顯著(p<0.01，p<0.05)； 在0 h時干擾NHE3組和PEDV感染組相比，干擾NHE3組細胞內(nèi)Na+質(zhì)量濃度下降比較顯著(p<0.01)．細胞外Na+質(zhì)量濃度的變化隨著時間延長逐漸升高(圖3b)．在感染后0 h時過表達NHE3組和干擾NHE3組相比，干擾NHE3組細胞外的Na+顯著低于過表達NHE3組(p<0.05)．

圖3 PEDV感染IPEC-J2細胞后檢測細胞內(nèi)外Na+質(zhì)量濃度

2.4 PEDV感染細胞后對NHE3總蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達NHE3組、干擾NHE3組和PEDV感染組細胞總NHE3蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義； 過表達NHE3組與干擾NHE3組、PEDV感染組以及干擾NHE3組和PEDV感染組相比，隨著感染時間的延長細胞總NHE3的蛋白表達變化無統(tǒng)計學意義(圖4)，說明總蛋白NHE3的表達量可能不受PEDV感染的影響．

圖4 PEDV感染IPEC-J2細胞后檢測總蛋白NHE3的表達

2.5 PEDV感染降低細胞膜上NHE3蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示(圖5)，過表達NHE3組和干擾NHE3組相比，干擾NHE3組的膜蛋白NHE3的表達水平顯著低于過表達NHE3組(p<0.01)； 過表達NHE3組和PEDV感染組相比，PEDV感染組的膜蛋白NHE3的表達水平顯著低于過表達NHE3組(p<0.05)； 干擾NHE3組與PEDV感染組相比，干擾NHE3組的膜蛋白NHE3的表達水平顯著低于PEDV感染組(p<0.05)； 干擾NHE3組和對照組相比，對照組的膜蛋白NHE3的表達水平高于干擾NHE3組．

圖5 PEDV感染IPEC-J2細胞后檢測質(zhì)膜上NHE3的表達

3 討論與結(jié)論

目前對PEDV的感染途徑、病理生理學等進行了廣泛的研究[3，22]，但PEDV誘導仔豬腹瀉的分子機制尚未明確．本研究在細胞水平上發(fā)現(xiàn)了PEDV感染IPEC-J2細胞后引起NHE3活性降低和蛋白表達量下降，為進一步探究PEDV感染后引發(fā)腹瀉奠定了基礎(chǔ)．

PEDV主要通過消化道和鼻腔感染，侵襲小腸并在小腸內(nèi)進行大量復制[3]，破壞小腸絨毛(空腸和回腸為主要感染部位)和大腸的絨毛上皮細胞[1，23-24]，擾亂了腸腔內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收電解質(zhì)的正常轉(zhuǎn)運(尤其是Na+)，從而使腸腔內(nèi)滲透壓升高，導致腹瀉．研究表明，NHE3蛋白的活性狀態(tài)及表達水平與腹瀉的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)．比如，NHE3引起了小鼠腸道對Na+和水的吸收急劇下降，導致嚴重腹瀉[15]．編碼NHE3的SCL9A3基因的錯義突變與先天性鈉腹瀉(CSD)有關(guān)[11]．腸細胞中NHE3蛋白的表達減少和定位錯誤也被認為是微絨毛包涵體病患者腹瀉的部分原因[25]．小鼠中NHE3基因的表達受到干擾時，會導致輕度腹瀉、血壓較低、代謝性酸中毒[16]．在霍亂毒素引起的腹瀉和嚴重腸炎條件下，NHE3的蛋白表達和活性受到明顯抑制[26-27]．以上研究均表明NHE3的活性變化與腹瀉的發(fā)生密切相關(guān)[12，28]．

本課題組前期已經(jīng)證明輪狀病毒(TGEV)感染小腸上皮細胞后，引起小腸細胞對胞外的Na+吸收水平降低，NHE3膜蛋白表達量下降．據(jù)此推測TGEV 感染豬小腸上皮細胞后，可能通過改變NHE3膜蛋白的表達和活性，減少小腸上皮細胞對Na+的吸收[21]．TGEV和PEDV的臨床癥狀極其相似[29]，又同屬α冠狀病毒，結(jié)合本實驗室前期研究以及相關(guān)文獻報道，發(fā)現(xiàn)輪狀病毒對NHE3蛋白水平及其生物活性有影響[30]，而PEDV感染條件下對NHE3影響的研究還鮮有報道．

為進一步確定PEDV感染IPEC-J2細胞后對NHE3活性和表達量的影響，本研究利用火焰原子吸收法檢測過表達NHE3，干擾NHE3以及PEDV感染時細胞內(nèi)外Na+的流動速率．結(jié)果顯示，過表達NHE3組、干擾NHE3組、PEDV感染組細胞內(nèi)Na+質(zhì)量濃度隨著感染時間的延長逐漸降低．0 h和24 h時，過表達NHE3組和干擾NHE3組相比，干擾NHE3組細胞內(nèi)Na+質(zhì)量濃度下降比較顯著； 0 h時，干擾NHE3組和PEDV感染組相比，干擾NHE3組細胞內(nèi)Na+質(zhì)量濃度下降比較顯著； 細胞外Na+質(zhì)量濃度的變化隨著時間延長逐漸升高．利用生物素?；瘜嶒炦M一步驗證PEDV感染對NHE3的影響，Western blot結(jié)果顯示，過表達NHE3組和干擾NHE3組相比，干擾NHE3組的膜蛋白NHE3的表達水平顯著低于過表達NHE3組； 過表達NHE3組和PEDV感染組相比，PEDV感染組的膜蛋白NHE3的表達水平顯著低于過表達NHE3組； 干擾NHE3組與PEDV感染組相比，干擾NHE3組的膜蛋白NHE3的表達水平顯著低于PEDV感染組．過表達NHE3組、干擾NHE3組和PEDV感染組總NHE3蛋白量感染前后無明顯變化，但質(zhì)膜上NHE3量卻隨感染時間顯著性下降，因此推測可能是PEDV感染后期能抑制NHE3向質(zhì)膜的易位，并刺激NHE3的直接降解，降低NHE3活性，從而影響腸上皮細胞正常的Na+/H+交換，成為腸道電解質(zhì)紊亂的重要因素之一．

本研究證明了PEDV感染IPEC-J2細胞后細胞膜上NHE3活性降低，阻礙了Na+轉(zhuǎn)運，導致腸道內(nèi)電解質(zhì)紊亂，進而引發(fā)腹瀉．研究NHE3在PEDV感染中的作用，為揭示PEDV感染引發(fā)仔豬腹瀉機理提供參考，也為抗病毒性腹瀉治療提供了新靶點．