郭藝博，劉怡文，楊海軍，代寧濤，周福有，高社干

食管癌作為最常見的惡性腫瘤之一，高低發(fā)區(qū)的發(fā)病率及死亡率相差甚遠，具有顯著的地域差異，其在不同地區(qū)的獨特發(fā)病機制提示環(huán)境因素可能是食管癌的重要致病因素之一[1]。河南省作為我國食管癌高發(fā)區(qū)，已經(jīng)將食管癌作為全省重點防控的疑難病癥之一[2]。因此，在高發(fā)區(qū)尋找食管癌高危人群的腫瘤標志物對于食管癌的病因?qū)W研究具有十分重要的意義[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)感染與高發(fā)區(qū)食管癌患者的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和生存率降低密切相關(guān)[4]。隨后進一步發(fā)現(xiàn)Pg在上消化道中呈上高下低分布，并在體外實驗中證實，Pg可通過免疫逃逸、自噬及Smad/YAP/TAZ相關(guān)信號通路促進食管癌的惡性進展[5-7]，為食管癌高發(fā)區(qū)人群提供了新的具有重要預后價值的生物標志物。因此構(gòu)建以食管癌組織、口腔及血液樣本為主體，搭配完整臨床病理及隨訪資料的生物樣本庫，對食管病因?qū)W研究及防治工作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象所有食管癌組織、口腔、血液樣本均來自2016年9月至2020年5月河南科技大學第一附屬醫(yī)院、安陽市腫瘤醫(yī)院行上消化道內(nèi)視鏡檢查及食管癌根治術(shù)的患者。納入標準：①年齡≥18歲；②組織病理學確診為食管癌且未經(jīng)過任何治療；③既往體健。排除標準：①近6個月有牙周或口腔治療史；②1個月內(nèi)服用過抗生素；③牙齒總數(shù)少于20顆(至少有4顆磨牙)；④傳染病史；⑤術(shù)前進行放化療治療。所有患者在收集臨床資料和標本前均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器設備生物樣本庫建于河南科技大學第一附屬醫(yī)院新區(qū)醫(yī)院分子生物實驗室，設有樣本預處理室及樣本儲藏室。配備樣本信息管理系統(tǒng)、高速冷凍離心機(Eppendorf)及-80 ℃超低溫冰箱(Thermo)并裝有溫度報警系統(tǒng)，可實時監(jiān)測樣品儲存環(huán)境。

1.3 主要試劑耗材試劑：DNA保護液，無液氮組織RNA保護液(QIAGEN)。耗材：無菌無酶EP管、EDTA抗凝采血管、口腔拭子、一次性活檢鉗、一次性內(nèi)鏡細胞刷、凍存管、凍存盒。器械：滅菌剪刀、滅菌鑷子、手術(shù)刀片、移液器。

1.4 患者臨床資料收集首先與臨床科室及病案室負責人溝通聯(lián)系，并告知病人及家屬，簽署知情同意書。通過臨床病案信息管理系統(tǒng)收集病人包括年齡、性別、個人史、家族史和聯(lián)系方式在內(nèi)的基礎信息，以及包括病理診斷、治療方案在內(nèi)的臨床信息。每3個月電話隨訪更新1次患者疾病進展情況，持續(xù)至第60個月，以手術(shù)當天開始至以食管癌導致的死亡事件為終點，統(tǒng)計所有入組患者的總生存時間，并排除非食管癌導致的死亡病例。

1.5 口腔樣本收集于患者入院后第二天刷牙前采集口腔樣本。采用一次性口腔拭子，于患者口腔4個象限第二、三磨牙的牙齦處，擦拭并旋轉(zhuǎn)拭子，將黏附有齦溝液的拭子放入DNA保存液中并置于冰盒內(nèi)，于30 min內(nèi)轉(zhuǎn)運至-80 ℃冰箱長期儲存。

1.6 血液樣本收集于患者入院后第二天采集血液樣本。用EDTA抗凝采血管采集3～5 mL外周靜脈血，隨后將血樣帶回實驗室于高速冷凍離心機4 ℃、3 000 r·min-1離心5 min，用移液器分別將血清、血細胞轉(zhuǎn)移至無菌無酶EP管，放置于-80 ℃冰箱長期儲存。

1.7 胃鏡樣本收集與胃鏡室及病理科負責人溝通聯(lián)系，收集行上消化道內(nèi)視鏡檢查的患者細胞刷及活檢樣本。于內(nèi)視鏡探測時，從內(nèi)視鏡活檢孔道依次將兩根一次性內(nèi)鏡細胞刷插至食管癌黏膜正常及病變處，擦拭4～5次后將細胞刷退出，折斷刷頭放入DNA保存液中，密封。再將兩根一次性活檢鉗沿內(nèi)視鏡活檢孔道依次插至距食管癌黏膜病變部位上方>5 cm食管正常黏膜及食管黏膜病變處，鉗取2～3塊組織，退出活檢鉗后，將組織分別放入已裝有無液氮組織RNA保護液(德國QIAGEN)的EP管中并置于冰盒內(nèi)，于30 min內(nèi)轉(zhuǎn)運至-80 ℃冰箱長期儲存。

1.8 手術(shù)樣本收集與手術(shù)室及病理科負責人溝通聯(lián)系，收集行食管癌根治術(shù)的患者所切除的食管標本中部分病變及正常黏膜組織。于距病變5 cm以外處，分離食管黏膜組織，放入已裝有DNA、RNA保護液的無菌無酶EP管中并置于冰盒內(nèi)。選取病變部位中心及邊緣處各取2塊，放入已裝有無液氮組織RNA保護液的無菌無酶EP管中，置于冰盒內(nèi)，于30 min內(nèi)轉(zhuǎn)運至-80 ℃冰箱長期儲存。

1.9 樣本預處理及質(zhì)量控制隨機對入庫樣本進行抽樣，利用液氮研磨法提取RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定A260 nm與A280 nm下的OD值以判定RNA純度，比值越接近2則代表RNA純度越高[8-9]。定期對樣本質(zhì)量及樣本信息的完整性進行抽檢，并根據(jù)抽檢結(jié)果適當調(diào)整樣本采集、轉(zhuǎn)運及儲存方法。

2 結(jié)果

2.1 樣本庫基本信息樣本庫自2016年9月至2020年5月于河南科技大學第一附屬醫(yī)院及安陽市腫瘤醫(yī)院共計收集164例食管癌患者活檢及285例手術(shù)樣本，每例樣本均具有配套口腔、血液樣本以及臨床病理資料。見表1。

表1 樣本庫臨床病理資料及一般特征 例(%)

2.2 樣本質(zhì)量控制每季度對入庫樣本隨機進行RNA抽提，經(jīng)紫外分光光度計測定純度并記錄。每季度對上季度抽檢樣本進行復檢，與首次提取對比后判定樣本質(zhì)量(圖1)。如差值較大，則及時對樣本采集、轉(zhuǎn)運及儲存方法進行適當調(diào)整。

圖1 隨機抽檢樣本庫RNA純度

3 討論

河南省作為我國食管癌高發(fā)區(qū)，在食管癌相關(guān)的流行病學調(diào)查、早期篩查、病因?qū)W及治療方面展開了大量的研究。由于缺乏有效的預防及篩查方法，食管癌患者往往在確診時已處于中晚期，其5 a生存率不足20%[10]，通過構(gòu)建高發(fā)區(qū)食管癌生物樣本庫為食管癌病因?qū)W研究提供一個穩(wěn)定可靠的樣本基礎十分必要。河南食管癌高發(fā)地區(qū)人口眾多且人員流動性較小，為在當?shù)卣归_流行病學調(diào)查提供了便利[11]。本課題組通過深入河南省食管癌高發(fā)區(qū)林州市進行流行病學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牙齒缺失與食管癌發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)[4]。而一種口腔條件致病菌Pg感染則正是口腔微生態(tài)失衡及牙周炎的重要致病菌，目前已有大量研究證實細菌感染與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如幽門螺旋桿菌與胃癌、肺炎衣原體與肺癌、人乳頭狀瘤病毒與宮頸癌等[12]。經(jīng)過進一步調(diào)研發(fā)現(xiàn)高發(fā)區(qū)食管癌患者的Pg感染率高達61%，且與其分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、生存率降低密切相關(guān)[4]。隨后通過體外細胞及體內(nèi)動物實驗進一步從免疫學、自噬以及小RNA角度展開其致病機制的研究[6-7,13-15]，為食管癌早期篩查及臨床防治策略的制定提供了重要的理論依據(jù)。生物樣本庫作為臨床與基礎研究互相轉(zhuǎn)化的重要橋梁，不僅能夠?qū)⑴R床樣本及信息資源的利用最大化，還能為臨床診治提供重要的理論依據(jù)[16]。樣本庫中組織及血液樣本主要用于PCR、Western blot、ELISA、組織芯片、免疫組織化學等基礎實驗，口腔拭子及內(nèi)鏡下細胞刷樣本可進一步經(jīng)測序后用于轉(zhuǎn)錄組及代謝組分析，臨床病理資料則用于統(tǒng)計學分析，隨訪資料可用于疾病進展及生存分析。自該生物樣本庫建立至今，累積為30余項科研項目提供樣本支持，其中包括國家自然科學基金面上項目3項，在SCI收錄研究論文20 余篇，累積影響因子>60。

河南科技大學第一附屬醫(yī)院及安陽市腫瘤醫(yī)院服務于食管癌高發(fā)區(qū)人群，在構(gòu)建食管癌生物樣本庫方面有著先天地理及人口優(yōu)勢，通過與兩院臨床科室、內(nèi)鏡室、手術(shù)室、病理科、科研科及醫(yī)務科等多方溝通協(xié)調(diào)，開展以口腔、組織、血液樣本為主的生物樣本庫構(gòu)建。在樣本采集、轉(zhuǎn)運及長期儲存方面，制定了嚴格的質(zhì)量控制體系，運用了大量輔助設備為生物樣本庫的穩(wěn)定可靠提供保障，并加以科學的管理方案及出入庫制度，為洛陽和安陽兩地的食管癌基礎研究及臨床應用提供了穩(wěn)定可靠的基礎資源。

綜上所述，該食管癌生物樣本庫建立了完善的樣本采集、轉(zhuǎn)運及儲存方案，配備了科學的管理制度，為有效利用食管癌高發(fā)區(qū)病例資源，推動食管癌病因?qū)W研究提供了堅實可靠的基礎資源。