王金環(huán)，谷夢(mèng)宇，于孫婉琪，牛丁忍，孫岸弢，代月*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia AA)[1]是一種骨髓衰竭性疾病，以外周血全血細(xì)胞減少以及骨髓有核細(xì)胞增生低下為特征，以貧血、感染、出血為主要臨床表現(xiàn)。近年來(lái)，AA的發(fā)病率逐年上升，其病勢(shì)纏綿，病情較重，給患者造成了巨大負(fù)擔(dān)，因此明確再障的發(fā)病機(jī)制，找到一條行之有效的治療方案，對(duì)于AA患者尤為重要[2]。眾所周知，AA的發(fā)病機(jī)制主要由3部分[3]所組成：種子學(xué)說(shuō)、蟲(chóng)子學(xué)說(shuō)、土壤學(xué)說(shuō)，即造血祖細(xì)胞功能異常；免疫機(jī)制的紊亂；造血微環(huán)境的異常。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的最新研究表明，骨髓造血生態(tài)位(bone marrow hematopoietic niche,BMHN)的異常是AA發(fā)病的核心環(huán)節(jié)之一[4-5]，而作為骨髓造血生態(tài)位的核心環(huán)節(jié)之一，干細(xì)胞的黏附性則逐漸成為了一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

我們經(jīng)前期使用補(bǔ)髓生血顆粒治療慢性再障與整合素β1、β2家族黏附分子的研究，表明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與整合素β1、β2家族介導(dǎo)的相關(guān)離子通道與信號(hào)途徑異常密不可分，且可能與免疫超蛋白家族介導(dǎo)的信號(hào)通路與離子通道具有一定的聯(lián)系。而ICAM-1作為一免疫超蛋白家族的一員，是否與慢性再障的發(fā)病機(jī)制有著一定的聯(lián)系？這是本次研究需要探討的內(nèi)容，基于此，本研究從外周血的角度，探討使用補(bǔ)髓生血顆粒治療慢性再障與外周血ICAM-1表達(dá)水平的聯(lián)系，從而為慢性再障的發(fā)病機(jī)制以及用藥方向提供更多的思路與依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入55例2020年1月—2020年4月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病房及門(mén)診治療的，符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的CAA患者，其中腎陰虛型27例，腎陽(yáng)虛型28例。腎陰虛型男17例，女10例，患者平均年齡為(41.04±9.27)歲，平均病程為(3.04±1.22)年；腎陽(yáng)虛型男13例，女10例，患者平均年齡為(42.17±5.86)歲，平均病程為(2.61±0.89)年，兩組基礎(chǔ)資料比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。同時(shí)選取20例健康志愿者作為對(duì)照組。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照張之南、沈悌等編寫(xiě)的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[6]：①臨床表現(xiàn)為發(fā)病較急性再障緩慢，貧血、感染、出血癥狀相對(duì)較輕；②血常規(guī)檢查示血紅蛋白下降速度較慢，網(wǎng)織紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及血小板減低，但未達(dá)到重型再障程度；③多部位骨髓穿刺顯示三系或兩系減少，至少一個(gè)部位增生不良。

1.2.2 中醫(yī)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照國(guó)家中醫(yī)藥管理局《血液病重點(diǎn)專(zhuān)科協(xié)作組慢性髓勞(慢性再生障礙性貧血)的中醫(yī)診療方案(2017版)》[7]：①癥狀：多有面色白、心悸氣短、頭暈乏力，脈沉細(xì)無(wú)力或沉細(xì)數(shù)；②慢性再生障礙性貧血病史。

1.2.3 中醫(yī)證候分型診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[8]：①腎陽(yáng)虛型癥狀為心悸氣短，頭暈乏力，面色蒼白，口唇、指甲色淡，腰膝酸軟，畏寒等，或伴有輕微出血或無(wú)出血癥狀，小便清長(zhǎng)，大便溏，舌淡，脈沉細(xì)無(wú)力或虛大；②腎陰虛癥狀為心煩，衄血，潮熱盜汗，面色蒼白，口唇、指甲色淡等，或伴有低熱，口渴引飲，小便黃，大便干結(jié)，苔薄，舌尖紅，脈細(xì)數(shù)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合中醫(yī)、西醫(yī)臨床及中醫(yī)證候分型診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②年齡在18～60歲；③發(fā)病后進(jìn)行西醫(yī)治療6個(gè)月無(wú)意義者；④無(wú)心、腦、腎及其他系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害者；⑤已簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①正處于妊娠、哺乳期；②對(duì)試驗(yàn)藥物或組成成分過(guò)敏者；③患有精神疾病或智力缺陷者；④正在參與其他臨床試驗(yàn)者；⑤合并其他血液系統(tǒng)嚴(yán)重疾病或其他惡性疾病者；⑥并發(fā)感染或大量失血。

1.5 脫落標(biāo)準(zhǔn)

①治療過(guò)程中并發(fā)嚴(yán)重不可控制的并發(fā)癥，如暈厥、休克等；②轉(zhuǎn)變?yōu)橹匦驮僬锨也豢煽刂普撸虎畚匆?guī)律服藥者。

1.6 治療方法

1.6.1 基礎(chǔ)治療

①免疫抑制；②促造血治療；③護(hù)肝治療。

1.6.2 補(bǔ)腎生血治療

治療組根據(jù)分型不同給與補(bǔ)髓生血顆粒Ⅰ、Ⅱ號(hào)方，腎陰虛型使用補(bǔ)髓生血顆粒Ⅰ號(hào)方(方含熟地黃20 g，仙靈脾 20 g，五味子20 g，黃芪40 g，紅參10 g，山萸肉15 g，枸杞子15 g，桑葚子15 g，補(bǔ)骨脂15 g，菟絲子15 g，女貞子15 g，雞血藤15 g)，腎陽(yáng)虛型使用補(bǔ)髓生血顆粒Ⅱ號(hào)方(方含附子5 g，黃芪40 g，巴戟天15 g，補(bǔ)骨脂15 g，仙靈脾15 g，鹿茸15 g，紅參15 g，仙茅15 g，熟地黃15 g，山藥15 g，首烏15 g，枸杞子15 g，雞血藤15 g)。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥廠制備成沖劑，每袋15 g，含生藥40 g，批準(zhǔn)文號(hào)：[黑衛(wèi)藥制字(1997)0048號(hào)]成人每次1袋，每日3次溫水沖服。服藥期間囑患者節(jié)飲食、適起居、免作勞，調(diào)情志。

1.6.3 支持治療

若患者治療期間(1)出現(xiàn)嚴(yán)重出血，輸注血小板懸液及相應(yīng)止血措施；(2)出現(xiàn)嚴(yán)重貧血，應(yīng)給予輸血治療；(3)出現(xiàn)嚴(yán)重感染，給予抗生素等相應(yīng)治療；(4)服藥期間盡量避免接種疫苗。

1.7 試驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 試驗(yàn)方法

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗夾心法檢測(cè)人外周血血清ICAM-1表達(dá)水平。

(1)標(biāo)本采集：囑治療組患者及健康志愿者空腹，清晨前往醫(yī)院，靜脈采血3 mL，置于真空采集管，室溫狀態(tài)下自然凝固10～20 min后，以2 500 r/min的頻率離心15 min獲得血清，吸取1～2 mL離心后血清置于離心管并放于低溫冰箱內(nèi)存貯。

(2)檢測(cè)流程：①設(shè)空白孔及樣品孔，空白孔不添加酶標(biāo)試劑②；在酶標(biāo)包被板上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣；③封膜后于37 ℃環(huán)境下進(jìn)行溫育，時(shí)間為30 min；④使用稀釋后的洗滌液洗滌5次；⑥再次加酶、溫育并洗滌；⑦加入顯色劑，避光顯色；⑧在450 nm的波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度，使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

1.7.2 檢測(cè)指標(biāo)

對(duì)入組患者治療前后及志愿者外周血血清中的ICAM-1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件處理數(shù)據(jù)，若符合正態(tài)分布且為計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用χ2檢驗(yàn)檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

脫落后(脫落原因：未規(guī)律服藥)治療組患者共50例，其中臨床治愈6例，占12%；顯效21例，占42%；有效18例，占36%；無(wú)效5例，占10%，臨床總有效率為90%，提示使用補(bǔ)腎生血之補(bǔ)髓生血顆粒對(duì)慢性再障患者有較好的臨床療效。比較兩證型的臨床總療效Z值為-2.019(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腎陽(yáng)虛的臨床總療效優(yōu)于腎陰虛型，這與朱丹溪的“陽(yáng)虛易治，陰虛難調(diào)”理論不謀而合，見(jiàn)表1。

表1 慢性再生障礙性貧血患者兩證型臨床總療效比較[例(%)]

2.2 中醫(yī)癥狀積分比較

治療組兩型患者治療后中醫(yī)證候總積分組內(nèi)比較Z值為-4.562和-4.217，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腎陰虛型與腎陽(yáng)虛型進(jìn)行組間比較Z值為0.675，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明補(bǔ)髓生血顆?？梢愿纳坡栽僬匣颊叩闹嗅t(yī)證候積分，且腎陽(yáng)虛型優(yōu)于腎陰虛型，見(jiàn)表2。

表2 慢性再生障礙性貧血患者中醫(yī)證候總積分對(duì)比分)

2.3 外周血ICAM-1表達(dá)水平比較

使用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩證型患者治療前ICAM-1的表達(dá)水平分析，P=0.927>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療前治療組兩證型與健康對(duì)照組分別比較，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后兩證型、兩證型與對(duì)照組相比較，P=0.032<0.05、P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示補(bǔ)髓生血顆粒能改善慢性再障患者外周血黏附分子ICAM-1的表達(dá)水平，且腎陽(yáng)虛型改善程度優(yōu)于腎陰虛型，可用于預(yù)測(cè)患者預(yù)后，見(jiàn)表3。

表3 慢性再生障礙性貧血患者兩證型治療前后外周血ICAM-1表達(dá)水平對(duì)比

3 討論

對(duì)于再障的治療方面，近年來(lái)西醫(yī)多采用造血干細(xì)胞移植、免疫抑制、促造血治療以及輸血等支持療法，但其副作用較大且較為昂貴，多不被患者所接受；而作為傳統(tǒng)文化的瑰寶，中醫(yī)傳統(tǒng)思想認(rèn)為，髓為腎之所化，正如《內(nèi)經(jīng)》所云：“腎主骨生髓”，且“精血同源”，故現(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家們多將慢性再障之發(fā)病之根定位于腎，采用補(bǔ)腎生血法進(jìn)行治療，并在補(bǔ)腎法的基礎(chǔ)上分支為不同流派。如團(tuán)隊(duì)學(xué)術(shù)帶頭人孫偉正教授主張補(bǔ)腎生血養(yǎng)髓法，以腎為核心；高萍教授等[9]則主張采取補(bǔ)益脾腎之法治療再生障礙性貧血；梁冰教授等[10]強(qiáng)調(diào)除補(bǔ)益脾腎法之外，亦要重視補(bǔ)益肝腎；以上諸位醫(yī)家或從腎出發(fā)，或從脾腎出發(fā)，或從肝腎論治，無(wú)論哪種療法，均取得了并且取得了不錯(cuò)的臨床療效[11]。故本研究?jī)H選取腎虛型再障患者加以試驗(yàn)研究。另一方面，補(bǔ)髓生血顆粒為團(tuán)隊(duì)帶頭人孫偉正教授的有效經(jīng)驗(yàn)方，孫教授團(tuán)隊(duì)針對(duì)此藥物的前期試驗(yàn)研究充足，已經(jīng)有效的證明了其有效性及科學(xué)性[12-14]，且設(shè)置健康對(duì)照組，有利于探析健康人與再障患者細(xì)胞間黏附分子表達(dá)水平的差異，從而進(jìn)一步分析細(xì)胞間黏附分子與再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制之間的聯(lián)系，故本次課題研究采用健康對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照研究。

補(bǔ)髓生血顆粒是國(guó)家級(jí)名中醫(yī)孫偉正教授的有效經(jīng)驗(yàn)方，本方以補(bǔ)腎填精養(yǎng)血為總體治療大法，以六味地黃湯為底方進(jìn)行加減化裁。方中熟地黃為君，補(bǔ)腎填精；配合山萸肉為臣，增強(qiáng)補(bǔ)腎生血之功效，同時(shí)利用山萸肉收澀之特點(diǎn)行以固攝，從而使腎精補(bǔ)而不散；方中還添加鹿茸之血肉有情之品用于益精血、填筋骨；佐以人參、黃芪、枸杞等大補(bǔ)氣血，氣血雙補(bǔ)從而相互為用；值得一提的是，方中除補(bǔ)腎養(yǎng)血之底方外，還依據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)的進(jìn)展添加了相關(guān)藥物，如調(diào)解機(jī)體免疫之豬苓[15-17]、白花蛇舌草[18]，升血小板與白細(xì)胞之雞血藤[19]，真正做到了中醫(yī)傳統(tǒng)文化與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的結(jié)合，從而古今并用顯奇效。

正如植物的茁壯生長(zhǎng)依賴(lài)于肥沃的土地一樣，骨髓造血細(xì)胞的正常發(fā)育同樣也離不開(kāi)一個(gè)好的造血微環(huán)境，而作為骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，骨髓基質(zhì)細(xì)胞是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所組成的，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞又可分泌多種造血因子，為造血干細(xì)胞的正常增殖分化提供重要的營(yíng)養(yǎng)支持。ICAM-1作為一種細(xì)胞間黏附分子，是細(xì)胞膜表面的糖蛋白，廣泛存在于造血與非造血組織中，其中在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的表達(dá)水平最高[20]。整合素LFA-1為ICAM-1的配體，在細(xì)胞黏附作用的發(fā)生過(guò)程中，配體與受體相互作用，調(diào)控骨髓基質(zhì)細(xì)胞與骨髓造血干細(xì)胞之間的黏附性，從而起到調(diào)控造血干細(xì)胞遷移與黏附的作用[21]，控制著整個(gè)造血生態(tài)位中的穩(wěn)定與平衡。此外，有研究表明，抗ICAM-1抗體能破壞造血干細(xì)胞在骨髓基質(zhì)細(xì)胞上聚集成堆，影響造血干細(xì)胞的歸巢[22]。綜上可見(jiàn)，ICAM-1可以介導(dǎo)造血干細(xì)胞歸巢[23]，并可有效增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓造血干細(xì)胞之間的黏附性，是骨髓造血生態(tài)位的調(diào)節(jié)因子[24]。本次使用補(bǔ)髓生血顆粒治療慢性再障的外周血ICAM-1表達(dá)水平對(duì)比發(fā)現(xiàn)，治療組治療前后相比，患者治療后的ICAM-1表達(dá)水平明顯低于治療前；治療前治療組與對(duì)照組相比，慢性再障患者ICAM-1的表達(dá)水平明顯低于健康志愿者；治療后治療組與對(duì)照組相比，慢性再障患者ICAM-1的表達(dá)水平仍然低于健康志愿者。提示慢性再障患者的外周血ICAM-1表達(dá)水平低于正常人，使用補(bǔ)腎生血法之補(bǔ)髓生血顆粒治療慢性再障，能夠有效地提高其外周血ICAM-1表達(dá)水平，具有較好療效。

綜上所述，使用補(bǔ)髓生血顆粒治療慢性再障能改善其臨床癥狀，提升外周血血象，增強(qiáng)外周血ICAM-1表達(dá)水平，且陽(yáng)虛型療效優(yōu)于陰虛型，可用于預(yù)測(cè)慢性再障患者的預(yù)后。補(bǔ)髓生血顆粒在提升外周血ICAM-1表達(dá)水平治療慢性再障上，可能是以下兩種機(jī)制：(1)通過(guò)增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓造血干細(xì)胞黏附性，介導(dǎo)造血干細(xì)胞歸巢等方面來(lái)改善骨髓造血生態(tài)位；(2)通過(guò)促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，從而促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌更多的造血因子，糾正骨髓造血。提示慢性再障的發(fā)病機(jī)制可能與外周血ICAM-1的異常表達(dá)相關(guān)，糾正異常表達(dá)的黏附分子，這可能是慢性再障的一種新型治療思路。