肖 喆，王 捷*，石 瑛, 2，王清華，李艷暉，譚梅娟

(1 太原師范學(xué)院 生物系，山西晉中 030619，2 山西工程科技職業(yè)大學(xué)，山西晉中 030619)

晉陽(yáng)湖位于山西省太原市晉源區(qū)，是華北地區(qū)最大的人工湖，享有“中國(guó)北湖”的美稱。晉陽(yáng)湖水體由汾河西干渠引入，與平原水體的性質(zhì)相似，最初用途是為太原市第一熱電廠提供冷卻用水，現(xiàn)主要以其為主體構(gòu)建城市公園[1]。藍(lán)藻生存環(huán)境廣泛，種類繁多，具有較高的研究?jī)r(jià)值和利用潛力。有研究表明，顫藻目(Oscillatoriales)和念珠藻目(Nostocales)等分類單元下的絲狀藍(lán)藻可固定大氣中的氮轉(zhuǎn)化為含氮化合物[2-3]。在研究結(jié)皮微藻多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)鞘絲藻亞科和顫藻科(Oscillatoriaceae)等中的絲狀藍(lán)藻可與沙土黏附以便形成生物結(jié)皮[4-6]，改善土壤環(huán)境。顫藻目和聚球藻目(Synechococcales)等中的藍(lán)藻在生產(chǎn)生物燃料等工業(yè)方面也具有良好的前景[7]。但某些種類在富營(yíng)養(yǎng)化水體中產(chǎn)生水華，并成為藻源毒素主要的制造者。晉陽(yáng)湖水體中生活著大量的藻類，目前對(duì)于晉陽(yáng)湖的藍(lán)藻甚至是其他藻類研究較少。因此，對(duì)于晉陽(yáng)湖絲狀藍(lán)藻的研究可為今后該湖藻類資源利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

藍(lán)藻為富氧光合自養(yǎng)藻類，形態(tài)簡(jiǎn)單、獨(dú)特且多樣，在多種環(huán)境中存活[8]，甚至可生活在溫度極高或極低的惡劣環(huán)境中[9]。中國(guó)對(duì)于藍(lán)藻分類學(xué)研究起步較晚，在解放后才正式開(kāi)始[10]，胡鴻鈞和魏印心等科學(xué)家為了中國(guó)藻類學(xué)的科研工作、教學(xué)及生產(chǎn)所需，將中國(guó)淡水藻類大多數(shù)屬重新整理，并編寫成《中國(guó)淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)》一書(shū)，該書(shū)已成為國(guó)內(nèi)藻類分類學(xué)研究的重要依據(jù)之一[11]。藻類分類學(xué)的主要工作包含命名、形態(tài)特征描述、分群歸類，并利用系統(tǒng)發(fā)育分析其親緣關(guān)系。近年來(lái)，藍(lán)藻分類不再只依靠形態(tài)學(xué)，而是基于多相分類方法(生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子數(shù)據(jù)等相結(jié)合)定義新類群和經(jīng)典藻類的分子表征[12-13]。顫藻目和聚球藻目中包含許多鑒定不明確的物種，分子分析證明它們是多系的，給分類工作增加了極大的阻力。

早期的分類系統(tǒng)中，顫藻目包括不含具異形胞的絲狀藍(lán)藻。2014年，Komrek等根據(jù)類囊體的超微結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析將顫藻目分為兩個(gè)目：顫藻目與聚球藻目[14]。目前，聚球藻目下有12個(gè)科：Heteroleibleiniaceae，細(xì)鞘絲藻亞科(Leptolyngbyaceae)，Oculatellaceae，偽魚(yú)腥藻科(Pseudanabaenaceae)，Romeriaceae，裂須藻科(Schizotri-chaceae)，Acaryochloridaceae, 管胞藻科(Chamaesiphonaceae), Coelosphaeriaceae, 平裂藻科(Merismopediaceae), Prochloraceae和聚球藻科(Synechococcaceae)。其中前6科包含絲狀藍(lán)藻形態(tài)的藻種[15]。顫藻目的成員其形態(tài)差異較小，但遺傳多樣性和變異性強(qiáng)，且均不含異形胞[16-17]。當(dāng)環(huán)境中的水溫和營(yíng)養(yǎng)物(尤其是磷)濃度高，水的流動(dòng)性不強(qiáng)時(shí)，顫藻的生長(zhǎng)趨于旺盛。因此，水庫(kù)、湖泊和水壩等地的顫藻會(huì)頻繁出現(xiàn)[18]。顫藻在生長(zhǎng)過(guò)程中可固定CO2，并生成生物燃料等物質(zhì)，但有些顫藻可產(chǎn)生藻毒素，過(guò)度繁殖可污染水資源，對(duì)水生動(dòng)物和人體健康造成損害[19]。對(duì)晉陽(yáng)湖水體中絲狀藍(lán)藻種類及數(shù)量調(diào)查是亟待研究解決的問(wèn)題。

本研究對(duì)晉陽(yáng)湖及周邊地區(qū)的藻類進(jìn)行采集與分類，觀察并記錄了藻類的生存環(huán)境及生態(tài)分布。分離純化其中的絲狀藍(lán)藻，觀察藻絲長(zhǎng)度、細(xì)胞長(zhǎng)寬、頂端細(xì)胞形態(tài)等，同時(shí)運(yùn)用16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定絲狀藍(lán)藻的遺傳屬性，以期對(duì)晉陽(yáng)湖藍(lán)藻種類有進(jìn)一步的了解，豐富該地區(qū)藍(lán)藻的多樣性，研究結(jié)果對(duì)預(yù)防湖泊藍(lán)藻水華的發(fā)生起到預(yù)警效果，對(duì)維護(hù)水資源環(huán)境穩(wěn)定與生態(tài)平衡提供科學(xué)數(shù)據(jù)，并為后續(xù)晉陽(yáng)湖藍(lán)藻資源利用與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻種采集和分離

樣品采集地為山西省太原市晉陽(yáng)湖，采樣時(shí)間為2019和2020年3月、6月、9月和11月4個(gè)月份，每月2次采集水體中的藻類植物，使用25號(hào)浮游生物網(wǎng)和鑷子、刷子等工具分別采集浮游和石頭等附著的藻類，采集地的詳細(xì)經(jīng)緯度信息見(jiàn)表1，采集點(diǎn)位置在圖1標(biāo)出。將采集到的新鮮藻樣帶回實(shí)驗(yàn)室鏡檢，并利用經(jīng)典的毛細(xì)管分離法[15]分離純化藻類，首先在倒置顯微鏡下挑取單個(gè)藻絲體，使用無(wú)菌水多次清洗，然后放入含有BG-11培養(yǎng)基[20]的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，確定為單克隆培養(yǎng)后可轉(zhuǎn)入到三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光周期為12 h∶12 h。純化后的藻種保存在太原師范學(xué)院淡水藻種庫(kù)中，其編號(hào)分別為JYH005、JYH008、JYH010、JYH012和JYH022。

圖1 紅色點(diǎn)顯示晉陽(yáng)湖的采樣地點(diǎn)

表1 山西省晉陽(yáng)湖采樣信息

1.2 顯微觀察和測(cè)量

將藍(lán)藻藻絲體制作成顯微玻片標(biāo)本，在Nikon ECLIPSE NI型光學(xué)顯微鏡下觀察，使用外接電腦的NIS-Elements D5.20軟件拍攝藻種的形態(tài)特征，并測(cè)量與分析藻絲、細(xì)胞長(zhǎng)寬等數(shù)據(jù)。每個(gè)樣本至少測(cè)定30個(gè)細(xì)胞的大小、藻體形態(tài)、鞘的形態(tài)、末端細(xì)胞的形狀等數(shù)據(jù)，并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行觀察和描述。

1.3 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提取的操作步驟：取適量藻液離心，去除上清培養(yǎng)基，大約濃縮1.5 mL新鮮的藻液來(lái)提取DNA。加入無(wú)菌蒸餾水，使用凍融法破除細(xì)胞。為使細(xì)胞裂解充分，加入PlantZol裂解液并金屬浴。然后利用DNA提取酚∶氯仿∶異戊醇(體積比為25∶24∶1)多次抽提上清液，使蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)變性沉淀，離心后去除沉淀。最后利用DNA不溶于乙醇的特點(diǎn)沉淀出DNA。室溫?fù)]發(fā)乙醇，加入無(wú)菌蒸餾水懸浮DNA，保存在冰箱中。

PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增16S rRNA序列所用引物為F1和1 492[21-22]。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含2.5 mmol·L-1dNTP 混合液2 μL，5 U·μL-1taq DNA 聚合酶 0.2 μL，10 μmol·L-1正反引物各2 μL，10× Easy Taq Buffer 2 μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O為10.8 μL。PCR的條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，此階段循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠并電泳，檢驗(yàn)產(chǎn)物，以確保獲得預(yù)期擴(kuò)增的序列。將純化的PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序工作交由北京華大基因公司完成。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

測(cè)序獲得的序列為ABI和SEQ兩種文件類型，可用BioEdit 7.0軟件處理，并上傳在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST進(jìn)行對(duì)比，下載不同相似度的同源序列，基于16S rRNA基因的序列在BioEdit7.0軟件中進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后手工編輯序列。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是在MEGA7.0軟件中構(gòu)建，鄰接法(neighbor-joining method, NJ)和最大似然法(maximum likelihood, ML)使用的模型為Kimura 2-parameter model[23]。所有的系統(tǒng)發(fā)育評(píng)估均計(jì)算1 000次重復(fù)。同樣利用MEGA7.0軟件通過(guò)最大似然分析(ML)驗(yàn)證了樹(shù)狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)分析

根據(jù)光學(xué)顯微鏡下觀察到的形態(tài)特征，鑒定出4株絲狀藍(lán)藻屬于聚球藻目，其中2株屬于細(xì)鞘絲藻亞科，2株屬于偽魚(yú)腥藻科，1株絲狀藍(lán)藻屬于顫藻目分類單元下的沙絲藻科。表2和圖2詳細(xì)描述了分離到的5株絲狀藍(lán)藻的形態(tài)特征。

A、B.JYH005，具明顯的鞘；C、D.JYH008, 含死細(xì)胞，偶爾具鞘；E、F.JYH010，具鞘，末端圓柱狀或漸細(xì)；G、H.JYH012, 藻絲體偶爾纏繞； I、J.JYH022，具鞘

表2 本研究中絲狀藍(lán)藻的形態(tài)學(xué)描述

2.2 分子系統(tǒng)分析

分離純化得到的5株絲狀藍(lán)藻的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖3所示，以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的紫色粘菌藻(Gloeobacterviolaceus)序列為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用NJ、ML和MP方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，本研究以MP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)為基準(zhǔn)，標(biāo)注了3種方法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)所計(jì)算出的支持率。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中顯示了所研究的5株絲狀藍(lán)藻聚為3個(gè)不同的大支系，JYH005與JYH012為細(xì)鞘絲藻亞科，JYH008與JYH022為偽魚(yú)腥藻科，JYH010為沙絲藻科。

節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表NJ，ML和MP構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的支持率，低于50%的未顯示

對(duì)JYH005、JYH008、JYH010、JYH012和JYH022五株絲狀藍(lán)藻進(jìn)行16S rRNA基因序列分析，將擴(kuò)增出的序列片段與BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列對(duì)比表明，藻種JYH005與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)節(jié)結(jié)絲藻(NodosilineanodulosaMH179051)相似度為98.9%；藻種JYH012與細(xì)鞘絲藻屬Lep-tolyngbyamargaretheana(FR798934)的相似度為99.1%；這表明藻種JYH012和藻種JYH005與細(xì)鞘絲藻科的親緣關(guān)系較近。藻種JYH008與Arthronemaafricanum(KM019913)的相似度為97%；藻種JYH022與偽魚(yú)腥藻科藍(lán)藻(KF246480)的相似度為97.2%，與其他藍(lán)藻的相似度低于90%，無(wú)法確定其屬的位置；所以藻種JYH008和藻種JYH022的親緣關(guān)系與偽魚(yú)腥藻科相近。藻種JYH010與塔爾沙絲藻(DesertifilumtharenseMW411006)的相似度為99.6%；與沙絲藻屬的藻種聚為一支，說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系較近。

3 討 論

藍(lán)藻又被稱為藍(lán)細(xì)菌，因此藍(lán)藻的分類受控于植物學(xué)和細(xì)菌學(xué)兩個(gè)學(xué)科。傳統(tǒng)分類主要依據(jù)藻類的形態(tài)特征，但某些藍(lán)藻會(huì)表現(xiàn)出可塑性，藻種之間的進(jìn)化關(guān)系難以準(zhǔn)確構(gòu)建[28]?，F(xiàn)代的藍(lán)藻分類修訂和重新構(gòu)建分類基于多相方法，藍(lán)藻分類的首要標(biāo)準(zhǔn)即為確定其分類單元的系統(tǒng)發(fā)育位置[29]。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)某些在形態(tài)方面難以分辨的藍(lán)藻(如顫藻目)分類起到了巨大的作用。

基因16S rRNA高度保守，具有“生物進(jìn)化分子鐘”的稱號(hào)。原核生物屬及屬以下水平的分類均可采用該基因序列，許多學(xué)者對(duì)這一基因序列的可靠性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果得到了肯定[30]。通常情況下，根據(jù)分離株的形態(tài)特征都可將其鑒定到屬水平，某些物種具有非常特別的形態(tài)特征的話，也可鑒定到種水平[31]。藍(lán)藻分子生物學(xué)研究對(duì)彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類體系的缺陷起到了關(guān)鍵的作用，提供了更完善的基礎(chǔ)基因數(shù)據(jù)，藍(lán)藻的分類學(xué)研究日益趨于完善，更親近于物種自然親緣關(guān)系的圖譜建立[32]。

本研究采用基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子16S rRNA序列結(jié)合的方法，對(duì)5株晉陽(yáng)湖絲狀藍(lán)藻進(jìn)行了表征。在這5株絲狀藍(lán)藻中，JYH012屬于細(xì)鞘絲藻屬，該屬由于缺乏典型的判斷特征或與相關(guān)類群有重疊特征，僅依靠形態(tài)特征無(wú)法準(zhǔn)確鑒定。事實(shí)上細(xì)鞘絲藻屬的形態(tài)特征極其簡(jiǎn)單，主要表現(xiàn)在藻體薄，藍(lán)綠色，無(wú)異形胞，藻絲體寬度小于3.5 μm，具鞘且每鞘只包裹著1個(gè)藻絲體，類囊體分布在細(xì)胞周圍[33-34]。而JYH012藻株藻絲體極細(xì)，藻絲單生或纏繞，橫壁收縊明顯，細(xì)胞內(nèi)偶爾可見(jiàn)顆粒狀，這與該屬的形態(tài)特征不同。JYH005屬于結(jié)絲藻屬，該屬的模式種為結(jié)節(jié)結(jié)絲藻(Nodosilineanodulosa)[24]，JYH005與該屬的典型特征基本吻合，但是在培養(yǎng)過(guò)程中未觀察到膨脹的鞘。JYH022為偽魚(yú)腥藻科，由于該藻株序列信息與該科其他屬的相似度低于90%，因此只能確定到科水平，物種之間的相似度低于94.6%即為不同屬[35]。JYH008與Komrek等修訂的屬Arthronema[25]形態(tài)特征基本一致，但是已報(bào)道的Arthronema形態(tài)未見(jiàn)死細(xì)胞，而對(duì)JYH008形態(tài)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)藻絲中有死細(xì)胞，可通過(guò)死細(xì)胞進(jìn)行繁殖。JYH010形態(tài)基本符合沙絲藻屬[26]所描述的形態(tài)特征，但是未在JYH010藻絲中觀察到氣囊，原因可能是實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件優(yōu)越，造成了表型的改變。

本研究以從山西省太原市晉陽(yáng)湖分離純化出的5株絲狀藍(lán)藻為實(shí)驗(yàn)樣品，利用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，并采用16S rRNA序列分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，確定其分類單元，對(duì)山西淡水湖泊絲狀藍(lán)藻種類有了進(jìn)一步的了解，為可能發(fā)生的水華的防控提供理論基礎(chǔ)，也為深度利用晉陽(yáng)湖絲狀藍(lán)藻生物資源提供有效信息。