祁椏楠，胡江偉，武 亮，高 倩，周雨聰，鄭慧霄

（邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院a.體檢中心;b.內(nèi)分泌科;c.腎內(nèi)科,河北邢臺(tái) 054000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一，發(fā)生率約占2 型糖尿病總?cè)藬?shù)的30%～35%[1]，亦是導(dǎo)致終末期腎病（endstage renal disease，ESRD）的首要原因[2-4]。因此，早期診斷DN 具有重要臨床價(jià)值。尿視黃醇結(jié)合蛋白（urinary retinol binding-protein，URBP）是反映腎近曲小管及腎功能早期損傷的較為理想指標(biāo)。miR-181b 屬微RNA（microRNA，miR）的一種，前期研究已證實(shí)[5]，可靶向調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3，在功能上參與DN的發(fā)病機(jī)理。另有研究發(fā)現(xiàn)，DN 發(fā)生可能與Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）異常表達(dá)存在一定關(guān)聯(lián)性[6]，但關(guān)于TLR-3，miR-181b，URBP表達(dá)與DN 病情程度的關(guān)系及聯(lián)合診斷價(jià)值仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證?；诖?，本研究檢測(cè)TLR-3，miR-181b，URBP表達(dá)，分析其對(duì)DN 患者的診斷價(jià)值及與預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，旨在為臨床診治、預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年12月～2018年12月邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院收治的115 例DN 患者作為觀察組，另選取同期96 例2 型糖尿病作為對(duì)照組。其中觀察組：男性68 例，女性47例，年齡42～69 歲，平均50.97±3.62 歲；體質(zhì)量52～76kg/m2，平均62.85±4.56kg/m2；糖尿病病程5.5～12.2年，平均9.26±1.28年。對(duì)照組：男性56例，女性40 例，年齡53～75 歲，平均63.11±4.92 歲；體質(zhì)量52～76kg/m2，平均62.85±4.56kg/m2；糖尿病病程5.0～12.4年，平均8.99±1.35年。兩組基本資料（性別、年齡、體質(zhì)量、糖尿病病程）均衡可比（P＞0.05）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1.觀察組均符合DN 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，并符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①6 個(gè)月內(nèi)連續(xù)尿液檢查有2 次尿清蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）為20～200 μg/min，或30～300 mg/24 h；②尿沉渣異常；③腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）≤60 ml/（min·1.73m2）。2.對(duì)照組均符合2 型糖尿病相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]，且空腹血糖（fasting plasma glucos，F(xiàn)PG）≥7.0mmol/L 或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）2 h 血糖≥11.1mmol/L。3.患者及家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病足潰瘍等嚴(yán)重并發(fā)癥者；②原發(fā)性腎病者；③并發(fā)風(fēng)濕性疾病、高血壓疾病或心血管疾病者；④既往有腎臟外傷或手術(shù)史者；⑤近期有免疫抑制劑或其他腎臟毒性藥物服用史者；⑥精神行為異常者。

1.2 儀器與試劑 ABI7900 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；BNP 特定蛋白分析儀（德國(guó)SIEMENS 公司）；速率免疫散射比濁法試劑盒（北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 URBP水平檢測(cè)：采集新鮮晨尿5 ml，采用BNP 特定蛋白分析儀以速率免疫散射比濁法檢測(cè)URBP水平。

1.3.2 血清TLR-3，miR-181b水平檢測(cè)：清晨空腹抽取肱靜脈血10 ml，4 500 r/min，離心10 min，分離取血清，檢測(cè)TLR-3，miR-181b 濃度，根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲取2 個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)待測(cè)基因位點(diǎn)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，其中TLR-3 上游引物為5’-AGCCTTCAACGACTGATGCT-3’，下游引物為5’-TTTCCAGAGCCCTGCTAAGT-3’；miR-181b 上游引物為5’-GCGGATCATTCATTGCTGTCG-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3。根據(jù)20 μl 模板、50 μl 反應(yīng)液構(gòu)成PCR 反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，93℃ 10 s，61℃ 30 s，反復(fù)循環(huán)40 次，61℃時(shí)采集熒光，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)TLR-3，miR-181b，并以2-△△Ct計(jì)算TLR-3，miR-181b 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 腎臟病理損傷程度：采用腎小管萎縮與間質(zhì)纖維化（IFTA）、間質(zhì)炎癥、腎小球分級(jí)評(píng)分進(jìn)行評(píng)估，其中IFTA 評(píng)分0分為無IFTA；1分為輕度，即病變程度＜25.0%；2分為中度，即病變程度25.0%～50.0%；3分為重度，即病變程度＞50.0%；間質(zhì)炎癥評(píng)分0分為無，1分為與IFTA 相關(guān)的炎性浸潤(rùn)，2分為無IFTA 區(qū)域也存在炎性浸潤(rùn)；腎小球分級(jí)I 級(jí)為單純腎小球基底膜增厚，Ⅱ級(jí)為系膜基質(zhì)增寬，Ⅲ級(jí)為結(jié)節(jié)性硬化，Ⅳ級(jí)為晚期糖尿病腎小球硬化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析法；URBP及血清TLR-3，miR-181b 診斷價(jià)值評(píng)價(jià)采用敏感度、特異度表示，并以Med Calc 繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值，以Hanley-McNeil 方法比較ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）。以α=0.05 為校驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組TLR-3，miR-181b，URBP 檢測(cè)水平比較 觀察組URBP（4.12±1.24mg/L vs 2.88±0.86mg/L）及血清TLR-3（0.86±0.27 vs 0.59±0.18），miR-181b（2.55±0.76 vs 1.79±0.54）水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.275,8.367,8.217,均P＜0.001）。

2.2 觀察組不同腎臟病理損傷程度TLR-3，miR-181b，URBP 檢測(cè)水平 見表1。觀察組不同腎臟病理損傷程度患者URBP及血清TLR-3，miR-181b水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 觀察組不同腎臟病理損傷程度TLR-3，miR-181b，URBP水平比較(±s)

表1 觀察組不同腎臟病理損傷程度TLR-3，miR-181b，URBP水平比較(±s)

腎臟病理損傷程度nTLR-3FPmiR-181bFPURBP（mg/L）FP間質(zhì)炎癥（分）2321.10±0.33 24.213 ＜0.001 3.36±1.01 29.028 ＜0.001 5.45±1.64 31.789 ＜0.001 1500.85±0.262.47±0.744.05±1.22 0330.64±0.201.89±0.572.94±0.88 IFTA 評(píng)分（分）3291.09±0.32 15.375 ＜0.001 3.53±1.06 24.236 ＜0.001 5.69±1.71 23.905 ＜0.001 2400.88±0.262.52±0.754.06±1.22 1300.76±0.232.07±0.623.42±1.03 0160.58±0.171.75±0.532.74±0.82腎小球分級(jí) Ⅳ241.05±0.31 13.906 ＜0.001 3.52±1.06 21.372 ＜0.001 5.98±1.80 27.603 ＜0.001Ⅲ450.93±0.282.64±0.804.18±1.25Ⅱ210.80±0.242.11±0.633.39±1.02Ⅰ250.60±0.181.83±0.552.84±0.85

2.3 腎臟病理損傷程度與TLR-3，miR-181b，URBP 相關(guān)性 見表2。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DN 患者間質(zhì)炎癥、IFTA 評(píng)分、腎小球分級(jí)與URBP及血清TLR-3，miR-181b水平呈正相關(guān)關(guān)系（均P＜0.05）。

表2 腎臟病理損傷程度與TLR-3，miR-181b，URBP 相關(guān)性

2.4 TLR-3，miR-181b，URBP 單獨(dú)及聯(lián)合診斷DN的ROC 曲線分析 見圖1。經(jīng)URBP及血清TLR-3，miR-181b及三者聯(lián)合診斷DN的AUC分別為0.751，0.782，0.796和0.880，三者聯(lián)合診斷AUC 大于單獨(dú)診斷（P＜0.05）。

圖1 URBP及血清TLR-3，miR-181b單一及聯(lián)合診斷DN的ROC 曲線

2.5 TLR-3，miR-181b，URBP與遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系 見表3。隨訪12 個(gè)月，13 例DN 患者失訪，其中4 例電話號(hào)碼錯(cuò)誤，4 例電話停機(jī)，5 例更換住址，剩余102 例共有35 例發(fā)展為ESRD，占比34.31%。根據(jù)ROC分析TLR-3，miR-181b，URBP 臨界值分組，當(dāng)其＞0.64mg/L，＞2.40mg/L，＞3.7 mg/L為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。URBP，miR-181b 高表達(dá)者ESRD發(fā)生率高于低表達(dá)者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表3 URBP及血清TLR-3，miR-181b與遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系[n（%）]

3 討論

腎臟活檢是既往臨床診斷DN的金標(biāo)準(zhǔn)，但其屬有創(chuàng)操作，臨床應(yīng)用受到一定限制[9]。因此，探尋一種理想的DN 診斷標(biāo)志物具有重要臨床價(jià)值。

miR-181b 參與機(jī)體生理、病理過程的調(diào)控過程[10-11]。本研究中，血清miR-181b 在DN 患者中過度表達(dá)，與王琳琳等[12]研究結(jié)果基本一致，并隨間質(zhì)炎癥加重、腎小球分級(jí)及IFTA 評(píng)分增加而升高，這可能歸因于長(zhǎng)期高糖狀態(tài)下，miR-181b表達(dá)顯著升高，可誘導(dǎo)體內(nèi)蛋白質(zhì)與血糖非酶結(jié)合，形成糖基化終末產(chǎn)物，產(chǎn)生過量自由基，進(jìn)而加重腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，破壞腎小球?yàn)V過屏障，導(dǎo)致持續(xù)性蛋白尿，從而造成細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積，加劇腎臟損傷程度，最終形成惡性循環(huán)。以上分析與結(jié)果說明miR-181b 參與DN的發(fā)生發(fā)展，可作為潛在分子生物學(xué)標(biāo)志物。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-181b 高表達(dá)可能增加DN 患者ESRD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，與王家芷等[13]觀點(diǎn)相似，說明高水平miR-181b 會(huì)影響DN 患者預(yù)后改善，早期檢測(cè)miR-181b水平有助于指導(dǎo)臨床評(píng)估預(yù)后。

TLR 信號(hào)是機(jī)體抵抗微生物感染的第一道防線，過度活化會(huì)導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞及化學(xué)因子大量釋放，自身抗體產(chǎn)生[14]。本研究數(shù)據(jù)表明，TLR-3 高表達(dá)可能參與DN 病理進(jìn)展。分析機(jī)制可能為TLR-3水平升高，可活化核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路，刺激CD80分子高表達(dá)，提高腎臟炎性反應(yīng)，加重巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)足突細(xì)胞融合，釋放大量蛋白尿水平，從而進(jìn)一步提高DN 發(fā)生危險(xiǎn)性。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清TLR-3水平與DN 患者腎臟病理損傷程度有關(guān)。DN 發(fā)生可激活TLR3 信號(hào)通路，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞釋放致炎因子，激活腎間質(zhì)固有細(xì)胞，導(dǎo)致腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積，介導(dǎo)腎臟病理損傷。提示以TLR-3 為靶點(diǎn)，抑制TLR-3表達(dá)，可能為預(yù)防DN 患者腎臟病理損傷提供新的策略。但TLR-3 高表達(dá)對(duì)DN 患者發(fā)生ESRD的影響小，可能與臨床尚未完全明確TLR-3在介導(dǎo)腎臟纖維化中的具體機(jī)制有關(guān)。

視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）是血液中轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇類物質(zhì)的載體蛋白，在尿液中較為穩(wěn)定[15]。曾福英等[16]報(bào)道指出，隨著DN分期進(jìn)展，RBP水平呈升高趨勢(shì)，可作為DN 早期診斷的標(biāo)志，支持本研究觀點(diǎn)。DN 發(fā)生時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞分化，可引起細(xì)胞功能紊亂，加重腎小管炎癥損傷，破壞腎小球?yàn)V過功能，主要表現(xiàn)為URBP水平異常升高[17]。經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析還顯示，URBP與DN 患者間質(zhì)炎癥、IFTA 評(píng)分、腎小球分級(jí)均存在正相關(guān)關(guān)系。充分說明URBP 有望成為評(píng)估DN 患者腎損傷的重要指標(biāo)。機(jī)制在于，URBP水平升高會(huì)進(jìn)一步破壞腎近曲小管重吸收功能，加重水鹽代謝紊亂，主要表現(xiàn)為尿液增多或水鈉潴留，從而加重腎臟病理損傷程度。另外，URBP 高表達(dá)會(huì)增加DN 患者ESRD 發(fā)生率，可能與腎小管細(xì)胞功能紊亂加重、脂聯(lián)素合成量減少有關(guān)。然而URBP 診斷DN的敏感度僅為56.52%，故本研究選擇聯(lián)合診斷，結(jié)果顯示，URBP及血清TLR-3，miR-181b 聯(lián)合診斷DN的AUC 為0.880，敏感度為72.17%，特異度為88.54%，提示三者聯(lián)合可能成為DN 診斷的潛在理想內(nèi)源性標(biāo)志物，為臨床提供治療新靶點(diǎn)。

綜上可知，URBP及血清TLR-3，miR-181b與DN 患者腎臟病理損傷程度有關(guān)，三者聯(lián)合可作為判定DN的生物學(xué)標(biāo)志物，指導(dǎo)臨床防治ESRD。但本研究未研究URBP及血清TLR-3，miR-181b之間相互調(diào)控關(guān)系及可能作用機(jī)制，今后需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，以期為DN 聯(lián)合靶向治療提供科學(xué)支持。