馬一銘 張崇霞 張宇沖 朱延光 嚴(yán)曉平 周 慶

(中儲糧成都儲藏研究院有限公司 610091)

真菌毒素目前已被認(rèn)為是食品安全中風(fēng)險因素之一。其中玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種主要由鐮刀菌屬的菌株在糧食上寄生后產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物毒素[1]，當(dāng)環(huán)境濕度達(dá)到較高時該毒素容易產(chǎn)生[2]。該毒素廣泛存在于各種谷物中，造成谷物形態(tài)變小和蛋白質(zhì)的減少，同時，對人類和牲畜引起巨大的危害，可導(dǎo)致疾病和死亡[3]。有研究表明，玉米容易被真菌定殖并產(chǎn)生真菌污染[4]，玉米赤霉烯酮(ZEN)雖然主要是在收獲前期產(chǎn)生，但如果玉米收獲后儲存在簡易的儲藏環(huán)境下，或者通風(fēng)干燥風(fēng)速過慢導(dǎo)致環(huán)境潮濕，玉米赤霉烯酮(ZEN)也會在此期間繼續(xù)產(chǎn)生[5]。未加工的玉米中所含有的玉米赤霉烯酮(ZEN)達(dá)到了51 μg/kg～192 μg/kg，據(jù)EFSA(2014)報道稱，兒童群體慢性飲食暴露在玉米赤霉烯酮中的含量達(dá)到了9.7 ng/kg～118 ng/kg，在成年人群體的含量達(dá)到了4.4 ng/kg～64 ng/kg。因此，急需要實用和高效的毒素降解措施降解糧食中真菌毒素，確保糧食安全，品質(zhì)良好。

目前，清除玉米赤霉烯酮(ZEN)的方法主要包括物理、化學(xué)和微生物降解法。通過化學(xué)降解法雖然效率高效，但存在成本高、產(chǎn)生二次污染和改變食品營養(yǎng)成分的弊端。如今綠色高效的糧食保護(hù)方法廣受糧食界的青睞，對生態(tài)環(huán)境的保護(hù)越來越受到人們的關(guān)注。臭氧作為自然界中廣泛存在的氣體，其降解產(chǎn)物為氧氣，因此不用擔(dān)心降解產(chǎn)物對環(huán)境的污染。同時臭氧作為強氧化物，對烯烴中的雙鍵具有親和力，可與多種化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[6]，破壞玉米赤霉烯酮毒素的分子結(jié)構(gòu)，達(dá)到利用臭氧氣體熏蒸糧食降解毒素的效果。隨著電化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，諸如質(zhì)子交換膜和電解技術(shù)，讓制造臭氧的途徑更加高效和簡易，僅需提供干燥空氣或者純氧氣就可實現(xiàn)連續(xù)長時間的合成。作為環(huán)境友好的氣體，臭氧熏蒸逐漸被作為一種降解真菌毒素的替代性技術(shù)。因此，在糧食上可以采用這種連續(xù)不斷產(chǎn)生的高濃度臭氧對被真菌毒素污染糧食進(jìn)行毒素降解[7]。

有研究表明，通過臭氧熏蒸被赤霉烯酮污染的玉米，能夠使玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素降解68.1%[1]。王軼凡等，通過20 mg/L的臭氧處理10 μg/mL的玉米赤霉烯酮(ZEN)溶液后，經(jīng)測定處理后液體發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生了4種未知的穩(wěn)定降解產(chǎn)物[8]。齊麗君等，向玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)溶液通入10 mg/L的臭氧，5 s后溶液中的ZEN被完全降解。同時，向含水量為14.1%的玉米籽粒中持續(xù)通入100 mg/L的臭氧，3 h后ZEN的降解率達(dá)到了86.0%，當(dāng)玉米水分提高到19.6%時，采用相同的方法處理玉米籽粒后其ZEN降解率達(dá)到了90.7%[9]，表明臭氧降解玉米赤霉烯酮的效果與玉米含水量呈正相關(guān)關(guān)系。Alexandre A等人，利用臭氧熏蒸被玉米赤霉烯酮(ZEN)污染的玉米全粉，向被污染的玉米全粉中通入51.5 mg/L 的臭氧，20 min和60 min后發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素降解率分別達(dá)到了60.2%和62.3%[10]。

1 材料與方法

1.1 玉米樣品中玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素含量測定方法

1.1.1 實驗材料 去離子水，玉米赤霉烯酮(ZEN)流動相[乙腈-超純水-甲醇(46∶46∶7，體積比)]，甲醇水(100%和80%)，磷酸緩沖液(PBS)，NaCl粉末。

1.1.2 實驗儀器 電子天平(感量為0.0001g和0.01g)，氮吹儀，渦旋儀，離心管，糧食粉碎機，高效液相色譜儀(AGILENT 1260 Infinity Ⅱ)，色譜柱[AGILENT C18色譜柱(150 mm×4.6 mm:粒徑4 μm)]，赤霉免疫親和柱(ZearaStarTM-Immunoaffinity Columns)，離心機。

1.1.3 實驗方法

1.1.3.1 玉米樣品前處理 取出適量的玉米樣品(約60 g～70 g)用粉碎機粉碎后過60目篩，取20.00 g樣品放入100.00 mL離心管中備用，加入2.00 g NaCl與50.00 mL的80%甲醇水，在25℃環(huán)境下，用渦旋儀2000 r/min的參數(shù)渦旋30 min后得到樣品液。將樣品液用超純水以2∶8的比例進(jìn)行稀釋后，用離心機以6000 r/min的參數(shù)離心5 min，取其上清液20.00 mL備用。將上清液通入赤霉免疫親和柱(ZearaStarTM-Immunoaffinity Columns)后，棄掉濾液，再用10.00 mL的PBS清洗緩沖液過柱清洗，最后用10.00 mL的超純水過柱清洗，棄濾液。用1.00 mL的100%甲醇洗脫免疫親和柱兩遍后，收集到洗脫液2.00 mL，用N2氣吹干2.00 mL的甲醇洗脫液后，再用2.00 mL的流動相溶解。將流動相用液體濾膜過濾后，獲得高效液相色譜(HPLC)待測液。

1.1.3.2 液體樣品前處理 將待測液體20.00 mL通入赤霉免疫親和柱(ZearaStarTM-Immunoaffinity Columns)后，棄掉濾液，再用10.00 mL的PBS清洗緩沖液過柱清洗，最后用10.00 mL的超純水過柱清洗，棄濾液。用1.00 mL的100%甲醇洗脫免疫親和柱兩遍后，收集到洗脫液2.00 mL，再用N2氣吹干2.00 mL的甲醇洗脫液后，再用2.00 mL的流動相溶解。將流動相用液體濾膜過濾后，獲得高效液相色譜(HPLC)待測液。

1.1.3.3 測定玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素含量 將高效液相色譜儀的參數(shù)設(shè)為：流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量為20 μL，玉米赤霉烯酮檢測波長中，激發(fā)波長為274 nm，發(fā)射波長為440 nm，最終根據(jù)測得峰面積計算出毒素含量。

1.2 實驗室內(nèi)臭氧處理玉米赤霉烯酮實驗

1.2.1 實驗材料 無雜質(zhì)玉米籽粒，玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/瓶)，去離子水。

1.2.2 實驗儀器 臭氧發(fā)生器，AL204分析天平，50 mL容量瓶，200 μL移液槍，1000 μL移液槍，渦旋震蕩儀，玻璃瓶，加絲自封口袋，臭氧破壞器，蒸餾水曝氣瓶，硅膠干燥瓶，不銹鋼三通閥，鐵架臺，硅膠管道，亞力克密封試驗管，臭氧濃度檢測儀，玻璃轉(zhuǎn)子流量計，變色硅膠。

1.2.3 實驗方法

1.2.3.1 臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)品溶液實驗 臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)品溶液毒素的裝置圖如圖1所示，每次使用前先開機檢查各個連接口的氣密性情況和變色硅膠氣體干燥瓶情況，如有漏氣則重新連接，變色硅膠干燥劑若已經(jīng)完全變色，則需要替換干燥好的硅膠。試驗開始前先準(zhǔn)備1 mg/L的玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 mL并倒入曝氣瓶中再接入閥門B的通道中，關(guān)閉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的閥門B，打開空瓶的閥門A，先開啟臭氧尾氣破壞裝置和臭氧濃度檢測儀，再開啟臭氧發(fā)生裝置，通過玻璃轉(zhuǎn)子流量計觀察當(dāng)氣體流量穩(wěn)定為3.5 L/min，并且臭氧濃度檢測儀讀數(shù)穩(wěn)定在100 mL/m3(±10)時，關(guān)閉閥門A同時打開閥門B讓氣體緩慢通過玉米赤霉烯酮溶液，并開始計時，當(dāng)通入時間分別達(dá)到了5 s、10 s、15 s、20 s、30 s、40 s、50 s、30 min時，立即停止計時，關(guān)閉臭氧發(fā)生裝置、閥門B和打開閥門A，并從經(jīng)臭氧處理一定時間的玉米赤霉烯酮溶液的瓶中移取10 mL樣液，裝入離心管做好對應(yīng)標(biāo)記待測毒素含量。按照以上步驟重復(fù)操作直至完成所有實驗。用HPLC高效液相色譜測定不同處理時間的樣液中玉米赤霉烯酮(ZEN)含量，每樣品測定3次，并記錄測定結(jié)果。

1.2.3.2 玉米籽粒加標(biāo)玉米赤霉烯酮(ZEN)毒素 從去除雜質(zhì)的玉米籽粒中挑選形態(tài)完整無破損的玉米完善籽粒，測定玉米初始平均水分為12.79%，并用自封口袋分裝成1200 g和900 g兩袋樣品，用量筒量取15 mL(考慮水分損失)去離子水噴灑至裝有900 g玉米粒的自封口袋中，待水分平衡幾天后，測定其最終水分為13.68%。用量筒量取67 mL(考慮水分損失)去離子水噴灑至裝有1200 g玉米粒的自封口袋中，待水分平衡幾天后，測定其最終水分為18.11%。

將1 mg玉米赤霉烯酮(ZEN)粉末完全溶解于10 mL純乙腈水中，再將ZEN-乙腈溶液用容量瓶添加去離子水定容至50 mL，配制成20 μg/mL的玉米赤霉烯酮(ZEN)20%乙腈水溶液靜置均勻后備用。將事先準(zhǔn)備好的水分為13.68%的900 g玉米粒樣品中加入10.5 mL已配制好的20 μg/mL的玉米赤霉烯酮(ZEN)溶液，將自封袋口封好后均搖加標(biāo)玉米粒數(shù)次，直至自封袋表面無明水后放入常溫下靜置數(shù)日。再向水分為18.11%的1200 g玉米粒樣品中加入9.2 mL已配制好的20 μg/mL 的玉米赤霉烯酮(ZEN)溶液，將自封袋口封好后均搖加標(biāo)玉米粒數(shù)次，直至自封袋表面無明水后放入常溫下靜置數(shù)日。測定混毒后的 900 g 和1200 g袋裝玉米籽粒中玉米赤霉烯酮的含量，分別為107.33 μg/kg和93.22 μg/kg。將測定后的樣品放入冰箱冷藏備用。

1.2.3.3 臭氧降解毒素加標(biāo)玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)試驗 臭氧降解玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)的裝置圖如圖2所示，每次使用前先開機檢查各個連接口的氣密性情況和變色硅膠氣體干燥瓶情況，如有漏氣則重新連接，變色硅膠干燥劑若已經(jīng)完全變色則需要替換干燥好的硅膠。臭氧熏蒸開始時檢查臭氧濃度檢測儀的濃度在1401(±100)mL/m3的范圍內(nèi)。當(dāng)濃度穩(wěn)定后，實驗期間保持臭氧氣體流速為4.5 L/min，并每隔0.5 h查看臭氧濃度是否在試驗濃度范圍內(nèi)，若有偏差則及時校準(zhǔn)至正確范圍。

將毒素含量為107.33 μg/kg的加標(biāo)玉米中每次取200 g樣品至亞克力試驗管中(如圖2所示)，密封好試驗管后用1401(±100)mL/m3的臭氧對加標(biāo)玉米籽粒進(jìn)行連續(xù)熏蒸處理，在常溫(25℃)環(huán)境下分別連續(xù)熏蒸4 h和8 h，再用間隔熏蒸模式，先用臭氧熏蒸4 h后停機間隔20 h后繼續(xù)用臭氧熏蒸4 h，最后在冷藏室低溫環(huán)境(-4℃)中用臭氧熏蒸8 h。所有處理完成后樣品散氣24 h，測定玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量，并記錄實驗結(jié)果。

以同樣的方法將毒素含量為93.22 μg/kg的加標(biāo)玉米中每次取200 g樣品至亞克力實驗管中(如圖2所示)，密封好試驗管后用1401(±100)mL/m3的臭氧對加標(biāo)玉米籽粒進(jìn)行連續(xù)熏蒸處理，在常溫(25℃)環(huán)境下分別連續(xù)熏蒸4 h和8 h，再用間隔熏蒸模式，先用臭氧熏蒸4 h后停機間隔 20 h 后繼續(xù)用臭氧熏蒸4 h。所有處理后樣品散氣24 h后，測定玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)的含量，并記錄實驗結(jié)果。

圖2 臭氧降解毒素加標(biāo)玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)實驗裝置示意圖

根據(jù)不同樣品和臭氧處理方式分析臭氧對玉米赤霉烯酮(ZEN)的降解率情況。

2 結(jié)果分析

2.1 臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)品溶液毒素實驗結(jié)果

臭氧為一種強氧化劑，能讓毒素的分子結(jié)構(gòu)被氧化而破壞，試驗期間保持臭氧通入濃度為100±10 mL/m3，臭氧流速為3.5 L/min，當(dāng)臭氧處理 5 s、10 s、10 s、15 s、20 s、30 s、40 s、50 s、1800 s(30 min)時暫停氣體通入并抽取10 mL處理液用于檢測毒素含量，毒素濃度檢測每次進(jìn)樣3次，檢查結(jié)果如表1所示。從圖3中可看出臭氧對玉米赤霉烯酮(ZEN)的降解率隨處理時間遞增而逐漸增加，當(dāng)處理時間達(dá)到30 min時，溶液中玉米赤霉烯酮被完全降解。表明臭氧對玉米赤霉烯酮毒素具有快速的降解作用。

表1 臭氧不同時間處理玉米赤霉烯酮溶液后毒素濃度含量情況

圖3 100±10 mL/m3臭氧降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的降解率隨時間變化情況

2.2 臭氧降解毒素加標(biāo)玉米籽粒中玉米赤霉烯酮(ZEN)實驗結(jié)果

通過用玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品液對兩種水分且不含玉米赤霉烯酮毒素的玉米完整粒進(jìn)行毒素加標(biāo)后，放入試驗設(shè)施中采用1401±100 mL/m3的臭氧濃度在不同溫度和處理時間情況下對加標(biāo)玉米進(jìn)行通氣處理，處理完成后從每批處理樣品中隨機抽取 100 g 籽粒進(jìn)行玉米赤霉烯酮含量檢測，每批樣品重復(fù)取樣檢測3次。不同方式處理后毒素含量情況如表2所示。從圖4A可以看出，臭氧連續(xù)處理時間越長毒素降解越多，表明玉米籽粒的毒素含量隨著通入臭氧時間會逐步降低。從圖4A、

表2 不同條件下臭氧降解兩種水分的玉米粒中玉米赤霉烯酮毒素情況

B中可以看出，當(dāng)玉米籽粒水分含量越高，臭氧對玉米赤霉烯酮毒素的降解率顯著提高，表明含水量高低影響臭氧降解毒素效率。從圖4C中可以看出，低溫條件(-4℃)下不利于臭氧降解玉米赤霉烯酮毒素，導(dǎo)致其降解效率顯著減慢。從圖4B中可以分析得出，低水分的玉米(13.68%)以連續(xù)4 h+間隔20 h+連續(xù)4 h的方式處理比以連續(xù)8 h的ZEN毒素降解率顯著增加，但同樣的兩種處理方式對高水分的玉米(18.11%)沒有顯著的降解率差異。

A.臭氧降解不同濕度玉米中毒素效果

圖4采用1401±100 mL/m3臭氧濃度處理含玉米赤霉烯酮的玉米樣品后的降解率情況。圖中不同小寫字母(a,b,c)表示不同處理之間的降解率差異性是否顯著。圖4A標(biāo)注為：玉米水分-連續(xù)臭氧處理時間；圖4B標(biāo)注為：玉米水分-臭氧處理方式，即連續(xù)是采用臭氧連續(xù)通入8 h，間隔是采用臭氧連續(xù)通入4 h后停止通氣20 h后再繼續(xù)通入4 h；圖4C標(biāo)注為：臭氧處理的環(huán)境溫度-臭氧處理時間。

3 討論

通過臭氧降解玉米赤霉烯酮室內(nèi)實驗表明，臭氧對玉米赤霉烯酮具有快速的降解效果，臭氧氣體通入含有玉米赤霉烯酮的溶液中，能夠快速與其反應(yīng)最終將其降解。對玉米籽粒的加標(biāo)實驗表明，玉米對玉米赤霉烯酮具有一定的吸收作用，向潔凈的玉米籽粒中加入玉米赤霉烯酮溶液能測出籽粒含有玉米赤霉烯酮，而且將樣品與玉米赤霉烯酮溶液混合均勻后可讓籽粒被均勻加標(biāo)。因此，用該種辦法加標(biāo)玉米能保證樣品毒素含量均勻，使標(biāo)樣適用于毒素降解試驗。

從臭氧處理玉米赤霉烯酮的加標(biāo)樣品的實驗可看出，臭氧對玉米加標(biāo)樣品中的玉米赤霉烯酮降解率，因不同臭氧處理條件而呈現(xiàn)不同的差異。實驗表明低溫將大幅度降低臭氧處理毒素的效率，因此選擇晴朗溫暖的天氣對儲糧進(jìn)行臭氧處理，將提高毒素降解效果。

從對比實驗結(jié)果可以看出，含水量越高的玉米將越有利于提高臭氧降解玉米赤霉烯酮的效率。因此，玉米含水量對臭氧處理效果具有顯著的影響，對于高水分的儲糧為了防止糧食霉變和真菌毒素的產(chǎn)生，可以進(jìn)行臭氧熏蒸處理有效地降低真菌毒素。

在臭氧處理模式方面，通過連續(xù)+間隔處理，可小幅度地提升含水量較低的玉米的臭氧降解效率，但對于高水分玉米降解率的提升效果卻不顯著。

4 結(jié)論

通過臭氧處理玉米赤霉烯酮溶液的實驗表明，臭氧對玉米赤霉烯酮具有明顯的降解效果，100 mL/m3的臭氧可在1 min鐘內(nèi)能將1 μg/mL玉米赤霉烯酮降解84%以上。

采用1401±100 mL/m3濃度的臭氧連續(xù)處理玉米赤霉烯酮加標(biāo)樣品，結(jié)果表明，臭氧可有效降解含有玉米赤霉烯酮的玉米籽粒，且降解效果受到不同處理條件的影響。其中玉米含水量和處理時的環(huán)境溫度對臭氧降解效果影響較大，含水量為18.11%的高水分玉米比含水量為13.68%的低水分玉米，降解率高出18%～23%，可能是由于臭氧具親水反應(yīng)效果，臭氧氣體可溶于水產(chǎn)生氧化自由基，因此，相比低水分的玉米籽粒，可快速與高水分玉米籽粒中的毒素反應(yīng)。相比常溫條件，在低溫下臭氧降解率顯著降低了21.5%，表明低溫不利于臭氧與玉米赤霉烯酮反應(yīng)，可能因為臭氧與玉米赤霉烯酮的化學(xué)反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，低溫不利于反應(yīng)的快速進(jìn)行，因此低溫條件下反應(yīng)速度較慢。