葛甜甜，王 楠，高 靜*，關(guān)思靜，徐蓉蓉，張亞麗，謝豐璞，李 瑞，嚴(yán)加坤，顏永剛，張 崗

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712083；3.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林，719000）

土壤鹽堿化已逐漸成為全球性的問題，其可降低土壤肥力，對植物的生長有較大的傷害。據(jù)報道，我國耕地的鹽堿化面積達(dá)到9913萬hm2，廣泛分布在西北干旱地區(qū)、東部沿海和東北等地區(qū)［1-2］。在自然環(huán)境下，根據(jù)土壤含鹽量和pH值，可分為中性、堿性和鹽堿混合型，其中中性鹽主要有NaCl和Na2SO4，堿性鹽有NaHCO3、Na2CO3［3-4］。土壤鹽堿成分通常頗為復(fù)雜，鹽化和堿化常同時發(fā)生，并且鹽堿混合是兩者的協(xié)同效應(yīng)對植物的傷害遠(yuǎn)大于單一鹽、堿脅迫［5-6］。土壤鹽堿脅迫會嚴(yán)重阻礙大多數(shù)的種子萌發(fā)，并且對胚的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，抑制植物正常的生長［7-8］，研究表明，高濃度的鹽堿處理抑制蓖麻種子萌發(fā)，使發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)降低［9］。趙穎［10］等研究發(fā)現(xiàn)藜麥種子萌發(fā)率隨鹽堿脅迫濃度的升高而下降并且在高pH下，幼苗在第7天開始腐爛，使其不能正常生長發(fā)育。鹽堿脅迫不僅能顯著抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，可通過增大細(xì)胞脂膜的透性以及膜脂過氧化反應(yīng)的速度提高，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的正常生理功能，導(dǎo)致植物體內(nèi)積累了大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），進(jìn)一步導(dǎo)致酶系統(tǒng)的損害［11］，使部分組織受到一定傷害。

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是一類具有生物活性的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，作為細(xì)胞內(nèi)源信號分子普遍存在于動植物組織中［12］。相關(guān)研究表明，當(dāng)植物面臨缺氧、低溫、高溫、高鹽堿等非生物脅迫時其含量會迅速提高，幫助植物抵御脅迫環(huán)境［13］。已有報道指出，葉面噴施GABA后，可提高甜瓜幼苗的抗氧化酶活性，緩解脅迫對植物光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應(yīng)中心的抑制作用，增強幼苗葉片的光合能力，從而提高甜瓜幼苗對鹽堿脅迫的抗性［14］。此外，GABA浸種能夠促進(jìn)低溫［15］和鹽堿脅迫［7］下甜瓜種子的萌發(fā)，并通過提高抗氧化酶活性緩解其脅迫造成的傷害。

甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）主要分布在東北、華北、西北等鹽漬化區(qū)域［16］，可以在輕微鹽堿地正常生長，但是近年來隨著土壤鹽漬化日益嚴(yán)重，大量研究發(fā)現(xiàn)高鹽高堿不利于甘草生長，導(dǎo)致其質(zhì)量與產(chǎn)量下降，無法滿足市場需求［17］。因此，本實驗以甘草種子為供試材料，通過研究不同濃度GA?BA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，探索外源GABA增加甘草耐鹽堿性的機(jī)理，為提高甘草種子和早期幼苗對鹽堿脅迫的抗性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為甘草種子，于2020年4月采自新疆烏魯木齊，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)黃文靜副教授鑒定為豆科植物甘草G.uralensis種子。收獲凈種后，經(jīng)打磨后放入編織袋內(nèi)，于2～8℃冷柜貯藏。

1.2 試驗方法

取適量的甘草種子用10%的H2O2消毒30 min，用蒸餾水沖洗干凈，吹干后將種子置于燒杯中倒入98%H2SO4浸泡30 min后用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，晾干，待用。以蒸餾水處理為對照（CK），NaCl濃度為100 mmol·L-1，將其標(biāo)記為NS；Na2CO3濃度為5 mmol·L-1，標(biāo) 記 為AS；混 合 鹽 堿 濃 度 為80 mmol·L-1NaCl+5 mmol·L-1Na2CO3（獲得 與中 性鹽 相 同 的Na+堿性溶液），標(biāo)記為NAS；γ-氨基丁酸（GABA）的濃度設(shè)置為0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 mmol·L-1，并將其標(biāo)記為G1、G2、G3、G4和G5。試驗采用拌種的方法（將不同濃度的GABA分別與NaCl、Na2CO3和NaCl+Na2CO3配制成不同的處理液，加入種子發(fā)芽床，使GABA始終貫穿整個處理過程），將待用的甘草種子均勻的鋪在2層濾紙、90 mm的培養(yǎng)皿中，加入適量的不同處理液，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)30粒種子，放入人工氣候箱中（溫度25℃，相對濕度75%，光暗周期交替為12 h/12 h）進(jìn)行萌發(fā)試驗。24 h后開始逐日觀察并補充相應(yīng)的處理液，直至發(fā)芽結(jié)束。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長指標(biāo)的測定

以胚根長1 mm作為種子發(fā)芽標(biāo)志，測定種子處理第1 d的發(fā)芽勢和第7 d的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)以及在第7 d每個處理選取9株幼苗用直尺測量胚根、胚軸和子葉的長度。

1.3.2 生理指標(biāo)的測定

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）采用氮藍(lán)四唑（QNBT）法測定，過氧化物酶（Peroxi?dase，POD）采用愈創(chuàng)木酚法測定，過氧化氫酶（Cat?alase，CAT）活性采用紫外分吸收法測定［18］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用Graphpad 8.0軟件進(jìn)行繪圖，利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗。

分別以甘草種子的發(fā)芽率（Germination percent?age，GP）、發(fā)芽勢（Germination potential，GP）、發(fā)芽指數(shù)（Germination index，GI）、活力指數(shù)（Vitality in?dex，VI）、鮮 重（Fresh weight，F(xiàn)W）、干 重（Dry weight，DW）、胚根長（Radicle length，RL）、胚軸長（Hypocotyl length，HL）、子葉長（Cotyledon length，CL）、SOD、POD和CAT共12個指標(biāo)，以及鹽、堿和鹽堿脅迫、5個GABA濃度處理作為2個變量組，用R軟件進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），分析3種脅迫及外源GABA與甘草種子萌發(fā)及幼苗生長的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子萌發(fā)的影響

由表1可知，鹽（92.22%）、堿（91.67%）和鹽堿脅迫（91.67%）與CK相比，種子的發(fā)芽率無顯著性差異（P>0.05），在鹽和堿脅迫下發(fā)芽勢分別下降了44.26%（P<0.05）、9.01%（P<0.05），活力指數(shù)在鹽、堿和鹽堿脅迫下分別下降了39.24%（P<0.05）、13.76%（P>0.05）、24.27%（P>0.05），而發(fā)芽指數(shù)只在鹽脅迫處理中下降了2.04%（P<0.05）。在鹽、堿脅迫條件下，施用不同濃度的GABA可提高甘草種子的發(fā)芽勢或活力指數(shù)，在鹽脅迫條件下，0.1mmol·L-1處理能夠顯著提高活力指數(shù)，提高了57.13%（P<0.05），在堿條件下，0.05、0.2和0.3mmol·L-1的GABA處理下發(fā)芽勢分別提高了18.91%、17.11%和4.49%（P<0.05）。

表1 外源GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下對甘草種子萌發(fā)指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of exogenous GABA on seed germination index of G.uralensis under saline，alkaline，and saline-alkaline stresses

2.2 外源GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草幼苗生長的影響

由表2可知，與CK相比，3種處理顯著抑制了甘草幼苗的胚根、胚軸或子葉的生長（P<0.05），其中，鹽處理顯著抑制胚軸和子葉的生長，堿處理顯著抑制了胚根和胚軸的生長，鹽堿處理則抑制了胚根和子葉的生長。不同濃度的GABA大部分可有效緩解三種脅迫對上述指標(biāo)的抑制作用。其中，鹽脅迫條件下，0.2 mmol·L-1的GABA處理對甘草幼苗的胚根、胚軸的促進(jìn)作用最顯著，分別為2.46 cm、1.46 cm。在堿脅迫條件下，濃度為0.5 mmol·L-1的GABA可顯著促進(jìn)胚根的生長，較AS增加了43.07%（P<0.05）。鹽堿混合條件下，GABA在0.05～0.3 mmol·L-1可提高胚根長和鮮重質(zhì)量，相比NAS胚根長度提高了11.76%～45.1%（P<0.05），鮮 重 提 高 了28.57% ～64.29%（P<0.05），并且，GABA濃度在0.3 mmol·L-1時達(dá)到最大，為1.48 cm、0.23 g。

表2 GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子生長指標(biāo)的影響Tab.2 Effect exogenous GABA on seedling growth index of of G.uralensis under saline，alkaline，and saline-alkaline stresses

2.3 GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖1可知，鹽脅迫處理顯著增加了甘草幼苗內(nèi)POD和CAT活性（P<0.05），外源GABA處理后的甘草幼苗內(nèi)SOD和POD活性表現(xiàn)出先下降后上升再下降的變化趨勢，且SOD在GABA濃度為0.2 mmol·L-1時活性 最 大，POD則在0.05 mmol·L-1的GABA時活性最大，與NS相比分別增加了8.82%（P<0.05），而CAT活性則表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，GABA在0.2mmol·L-1時達(dá)到最大。

圖1 GABA對鹽脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effect of melatonin on antioxidant enzyme activities of G.uralensis seedling under saline stress

由圖2可知，與CK相比，堿脅迫處理顯著抑制了SOD和POD活性（P<0.05），分別下降了24.03%、15.79%。外源施加不同濃度的GABA后SOD、POD和CAT活性大部分顯著增加。其中，0.3 mmol·L-1的GABA處理下對POD和CAT活性的效果最為明顯，是NS的1.77倍、4.48倍（P<0.05）。0.5 mmol·L-1的GABA處理顯著提高了SOD活性，使其增加了18.25%（P<0.05）。

圖2 GABA對堿脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of melatonin on antioxidant enzyme activities of G.uralensis seedling under alkaline stress

由圖3可知，與CK相比，鹽堿脅迫處理下SOD和POD活性均顯著增加（P<0.05），上升幅度分別為17.9%、55.67%。與NAS相比，SOD和POD活性隨著GABA濃度的升高呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢，且0.05、0.5mmol·L-1的GABA下達(dá)到最大，SOD活性增加了10.26%、12.9%（P<0.05），POD活性增加了16.87%、17.67%。CAT表現(xiàn)出隨外源GA?BA濃度的增加而先上升后下降的變化趨勢。GA?BA濃度在0.2、0.3mmol·L-1時達(dá)到最大，分別增加了19.50%、21.24%（P<0.05）。

圖3 GABA對鹽堿脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of melatonin on antioxidant enzyme activities of G.uralensis seedling under saline-alkaline stresses

2.4 GABA、鹽、堿和鹽堿脅迫與種子萌發(fā)和幼苗生長參數(shù)的冗余分析

由圖4A可知，F(xiàn)W、DW、CAT、POD與NAG1、NSG3、NS呈正相關(guān)，NSG4、NSG5與CL、SOD相關(guān)性強，GP、GF、GI、VI、RL、HL與CK、NSG2呈正相關(guān)，而NS與其呈負(fù)相關(guān)。由圖4B得知，AS與SOD、CAT、POD、GP、GI、RL、HL、CL、DW呈負(fù)相關(guān)。ASG2、ASG4與GP、DW、POD和CAT相關(guān)性強，ASG5與GF、GI、VI、RL、HL、CL和SOD呈正相關(guān)。由圖4C可知，NAS、NASG1、NASG3、NASG5與POD、CAT、SOD、HL、GF、GI呈正相關(guān)，NASG2和NASG4與FW、DW和GP呈正相關(guān)。

圖4 外源GABA對鹽（A）、堿（B）和鹽堿脅迫（C）下甘草種子萌發(fā)和幼苗生長參數(shù)RDA二維排序圖Fig.4 RDA sequence of exogenous GABA on germination and growth parametersof G.uralensis seeds under saline（A），alkaline（B）and saline-alkaline stressessaline-alkali stresses（C）

3 討論與結(jié)論

植物的整個生育期中，種子萌發(fā)階段是植物體生命的開始，也是植物生長最敏感和關(guān)鍵的階段，這時期土壤鹽分過高會嚴(yán)重抑制種子的萌發(fā)［19］。本實驗研究結(jié)果表明，鹽、堿和鹽堿脅迫顯著降低了甘草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，并且抑制了甘草幼苗的胚根、胚軸和子葉的生長，這與王妍［20］等的研究結(jié)果一致。同時，本實驗發(fā)現(xiàn)鹽、堿和鹽堿脅迫對種子的發(fā)芽率沒有顯著影響，據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，甘草具有較強的抗寒、抗旱和抗鹽堿能力，可在輕微的在鹽堿地生長［16］，因此推測在較高的鹽堿環(huán)境下不影響甘草種子的萌發(fā)率，但是會阻礙早期幼苗的正常生長。本研究中，外源GABA可提高鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，這與前人研究表明GABA能夠顯著緩解鋁脅迫對種子的傷害，提高鋁脅迫下種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的結(jié)果一致［13］。此外，GABA可有效緩解三種脅迫對胚根、胚軸和子葉生長的抑制作用，其中0.2 mmol·L-1的GABA處理可促進(jìn)鹽堿脅迫下對甘草幼苗的胚根伸長和鮮重的積累，說明外源GABA具有加快鹽堿脅迫下萌發(fā)期甘草種子生長進(jìn)程的作用。有研究表明，外源GA?BA能緩解高溫脅迫對水稻幼苗生長的抑制作用，并且可增加株高和根長的干物質(zhì)，這與外源GABA增加內(nèi)源GABA的含量有關(guān)［21］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在低溫、高溫、鹽和干旱等脅迫下，GABA含量增加的同時乙烯含量增加［22］，說明了外源施加GABA后，種子萌發(fā)期在逆境脅迫下可積累一定的GABA，其能夠促進(jìn)乙烯的合成，以此來消減脅迫環(huán)境對種子萌發(fā)與幼苗生長的抑制作用。

植物在正常生長條件下，體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡且不會對細(xì)胞膜造成傷害，當(dāng)植物在低溫、高溫、干旱和鹽堿等逆境時，這種動態(tài)平衡被打破，造成了ROS的大量積累，對細(xì)胞造成了不同程度的氧化傷害，同時植物體內(nèi)會啟動自生的抗氧化酶系統(tǒng)，以此來清除過多的ROS，增強植株抗逆性［23-24］。植物體內(nèi)三種常見的抗氧化酶為SOD、POD和CAT，這三種酶活性的高低可直接反應(yīng)植物耐逆境脅迫的能力。研究表明，GABA可通過調(diào)控植物的抗氧化防御系統(tǒng)來緩解其逆境脅迫［25］，例如，王泳超［26］等在玉米種子耐鹽性的研究中表明，鹽脅迫導(dǎo)致玉米幼苗中丙二醛（MDA）和超氧陰離子（O2.-）含量升高，但用GABA浸種后有效降低了MDA和O2.-的升高幅度，且提高了鹽脅迫下玉米幼苗內(nèi)SOD、POD和CAT活性。本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫中，0.05 mmol·L-1的GABA可提高POD活性，0.2 mmol·L-1的GABA可提高SOD和CAT活性；在堿脅迫下，0.3 mmol·L-1的GABA處理后甘草種子發(fā)芽過程中SOD、POD和CAT活性均顯著增加；鹽堿脅迫處理后甘草幼苗內(nèi)的SOD、POD和CAT活性均顯著上升，說明了鹽堿脅迫造成種子萌發(fā)過程中氧化傷害，甘草自身可以通過提高抗氧化酶活性以降低鹽堿脅迫的傷害。冗余分析結(jié)果表明，不同脅迫下，GABA對甘草幼苗抗氧化酶活性的影響不同，其中，鹽堿脅迫下0.05 mmol·L-1、0.2～0.5 mmol·L-1的GABA與SOD、POD、CAT三種酶活性相關(guān)性均很強，這與上述鹽堿脅迫可提高甘草自身抗氧化酶活性的結(jié)果一致，同時，外源GABA可進(jìn)一步使植物產(chǎn)生更多的抗氧化酶活性來抵御鹽堿脅迫對種子萌發(fā)及幼苗生長的傷害。此外，王泳超［27］等研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源GABA含量與SOD、POD和CAT三種抗氧化酶活性呈顯著正相關(guān)。Mahmud［28］等在芥菜對鉻脅迫耐受性的研究中發(fā)現(xiàn)，GABA可上調(diào)酶類抗氧化劑，如谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、SOD、POD、CAT，以此減少氧化損傷。這說明了GABA可能作為一種信號分子通過上調(diào)抗氧化防御系統(tǒng)的酶活性，誘導(dǎo)有利于抗氧化酶活性的某些基因的表達(dá)。

綜上所述，鹽、堿和鹽堿脅迫會抑制甘草早期幼苗生長。外源添加GABA提高種子的發(fā)芽勢和活力指數(shù)，還可以通過提高SOD、POD和CAT活性來維持細(xì)胞內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而緩解鹽堿脅迫對甘草早期幼苗的傷害。