閆曉彩，丁文歡，敬曉莉，徐海燕

（新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011）

紫草作為一種傳統(tǒng)中藥，在國內(nèi)外均有研究。在國內(nèi)，新疆紫草主要分布于天山南北坡和西藏的西部，國外如尼泊爾、巴基斯坦、阿富汗等地也有分布。其主要生長于高海拔地區(qū)的山地、草地及草甸等處。紫草含有醌類、酯類、酚酸類、脂肪族及黃酮、多糖[1-6]等成分，其中國內(nèi)外對(duì)其醌類成分研究較多。發(fā)現(xiàn)紫草的醌類成分具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及促進(jìn)傷口愈合[7]等作用。

本研究采用紅外光譜法及HPTLC 法，簡單、快速的建立紫草的紅外圖譜及薄層色譜，為不同產(chǎn)地新疆紫草的快速鑒別提供了幫助，也為后續(xù)研究提供了一種高效、快速的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

SpectrumⅡ型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；YP-2 型壓片機(jī)（上海山岳科學(xué)儀器有限公司）；AB265-S（1/10 萬）型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；多功能粉碎機(jī)（上海緣沃工貿(mào)有限公司）；KQ5200DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀儀器有限公司）；HH-S4 型數(shù)顯恒溫水?。ń饓嗅t(yī)療儀器廠）；薄層色譜展開缸（100mm×200mm；中國上海）；移液管；100μL 微量進(jìn)樣器（中國上海安亭微量進(jìn)樣器廠）；CAMAG 掃描儀、CAMAG 數(shù)字成像系統(tǒng)、CAMAG 半自動(dòng)定位儀器，均來自瑞士CAMAG。

KBr（光譜純 經(jīng)過研磨后烘干并密封備用）；HPTLC 硅膠G 板（20210319 安徽良辰硅源材料有限公司）；凈化水（新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室自制）；石油醚、甲醇、乙酸乙酯、二甲苯、甲酸，純度大于99%，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；左旋紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素，均為10mg，純度＞98%，Tauto Biotech。

表1 新疆紫草編號(hào)及來源Tab.1 Numbers and sources of Arnebia euchroma

1.2 樣品處理

1.2.1 紅外光譜樣品制備 將新疆紫草粉碎后過200 目篩，取1g 置于EP 管中，密封保存。為減少H2O的影響，實(shí)驗(yàn)前將藥材置于60℃烘箱進(jìn)行干燥4h，KBr 置于120℃烘箱干燥5~6h（KBr 應(yīng)少量多次進(jìn)行干燥）。

1.2.2 薄層色譜樣品制備 稱取樣品各1g，加入40mL 石油醚，100Hz 超聲40min，過濾后將濾液置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用甲醇將其溶解并定容至1mL，濃度為1g·mL-1。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備 分別稱取5.00mg 左旋紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、乙酰紫草素及β,β-二甲基丙烯酰紫草素4 種化學(xué)成分，用甲醇將之溶解，定容至5mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜采集

先將光譜儀預(yù)熱1h。以空白KBr 為背景，將片制成厚度約為1mm 透明薄片，20s 后取出。將完好壓片放入紅外光譜分析儀中掃描，掃描條件：以400~4000cm-1作為掃描范圍，掃描次數(shù)為16 次，分辨率為4cm-1。新疆紫草以每份2.0mg 與KBr 按1∶80比例混合，研磨均勻后進(jìn)行壓片、掃描，得光譜圖并導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

2.1.1 各紫草的紅外光譜及特征 將峰值及編號(hào)輸入OriginPro 8.5.1 軟件，以波長為橫坐標(biāo)，透射率為縱坐標(biāo)，設(shè)置各樣本間距為0.15，制作不同產(chǎn)地新疆紫草的紅外光譜，見圖1。

圖1 新疆紫草紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of Arnebia euchroma

由圖1 可見，除個(gè)別新疆紫草外，所有紫草均在3400、2920、1735、1615、1513、1425、1376、1260、1053、600、535cm-1附近有吸收。其中，超3/4 的新疆紫草在2852、465cm-1附近有吸收；超1/2 的新疆紫草770、672cm-1附近有吸收；X-6、X-7、X-9、X-10、X-15、X-16 在810-831cm-1之間有吸收；X-5、X-7、X-16 在1335cm-1附近有吸收；X-3、X-5、X-8 在1155 cm-1附近有吸收；只有X-6 在1105cm-1附近有吸收；部分新疆紫草在1033cm-1附近有吸收。

2.1.2 各紫草的相似度分析 利用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，均以1 號(hào)產(chǎn)地紫草為對(duì)照，進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表2。

表2 新疆紫草的相似度分析Tab.2 Similarity analysis of Arnebia euchroma

由表2 可得，各紫草的相似度均大于0.97，即藥材的質(zhì)量存在較小的差異。

2.1.3 各紫草的聚類分析 利用SPSS 21.0 軟件將新疆紫草進(jìn)行聚類分析。用平均連接法樹狀圖，以歐式距離平方為基準(zhǔn)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 新疆紫草聚類分析圖Fig.2 Analysis of Arnebia euchroma cluster analysis

由圖2 可知，當(dāng)歐式距離為15 時(shí)，新疆紫草可以分為3 類；當(dāng)歐式距離為20 時(shí)，新疆紫草可以分為兩類；當(dāng)歐式距離大于25 時(shí)，新疆紫草才可以歸為1 類。

2.2 高效薄層色譜法的檢測結(jié)果

樣品需經(jīng)過濾膜（0.22μm）過濾。經(jīng)過多次調(diào)整，最終確定了展開條件以石油醚∶二甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸為6∶4∶0.5∶0.5 最佳。各樣品設(shè)置點(diǎn)樣量為2μL,白光照射，獲得其日光圖，見圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品日光圖Fig.3 Chromatograms of the standardsand samples taken under white light

將4 種化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)品與樣品在400~700nm處用TLC 掃描儀掃描，測定最大吸收波長為522nm。

2.2.1 方法學(xué)考察

（1）線性 分別精確吸取左旋紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧及乙酰紫草素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL；β,β-二甲基丙烯酰紫草素0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μL。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量作為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4 種成分的回歸方程分別為y=5313x+6307.4，R2=0.9912；y=4851.4x+3953.8,R2=0.9947；y=4431x+5690.9,R2=0.9902 和y=5081.1x+1178.2，R2=0.9987。

（2）精密度 精確吸收各標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0μL 進(jìn)樣6 次后，檢測其峰面積，發(fā)現(xiàn)4 種化學(xué)成分的RSD分別為2.57%、2.37%、2.67%及2.71%，均小于5%。

（3）穩(wěn)定性 精確吸收同一批樣品（X-7），檢測在0、6、12h 時(shí)的峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，X-7 中4 種化學(xué)成分的RSD 分別為0.07%、2.85%、2.02%、0.86%。

（4）重復(fù)性 根據(jù)供試品制備方法提取6 份同一樣品（X-7），進(jìn)樣6 次后，檢測其峰面積，發(fā)現(xiàn)4種化學(xué)成分的RSD 分別為2.75%、2.85%、1.16%及1.79%。

（5）加標(biāo)回收率 通過線性已知各樣品含量，稱量約為1g 的X-4 粉末，分別加入約為樣品含量的80%、100%和120%的4 種化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)溶液。各平行制備3 個(gè)樣品，通過峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果Tab.3 Results of the recovery test

由表3 可知，左旋紫草素的回收率在98.00%~102.06%之間，平均回收率為99.68%；β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧的回收率在98.16%~101.65%之間，平均回收率為100.21%；乙酰紫草素的回收率在96.32%~102.92%之間，平均回收率為100.20%；β,β-二甲基丙烯酰紫草素的回收率在96.04%~100.94%之間，平均回收率為98.10%。說明該方法對(duì)4 種化學(xué)成分的測定準(zhǔn)確可靠。

（6）含量測定 在522 nm 處掃描測定18 批新疆紫草中4 種化學(xué)成分的峰面積，并將其帶入對(duì)應(yīng)的線性方程，計(jì)算其含量，結(jié)果見表4。

表4 各樣品中4 種成分含量測定結(jié)果（mg·g-1）Tab.4 Results of the content of the four components ineach sample（mg·g-1）

2.3 討論

經(jīng)研究報(bào)道，左旋紫草素具有抗宮頸癌及抑制破骨細(xì)胞分化的作用[8,9]。β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧具有抗食管癌的作用[10]，乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素均具有抗結(jié)腸癌的作用[11]。其中乙酰紫草素還具有抑制乳腺癌的發(fā)生、改善肺炎、抗黑色素瘤等多種抗癌作用。

與《中國藥典》相比，展開劑石油醚∶二甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸為6∶4∶0.5∶0.5 的條件下，分離度更好且二甲苯比苯的毒性更低，更有益于人體健康與綠色環(huán)境。

3 結(jié)論

（1）本研究采用紅外光譜，將光譜圖進(jìn)行13 點(diǎn)平滑，基線校正后，對(duì)18 批新疆紫草進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)各紫草間的相似度較高。故紅外光譜無法更好的區(qū)分各紫草，其只能證明各紫草中所含官能團(tuán)差異較小。

（2）高效薄層色譜研究發(fā)現(xiàn)，18 批新疆紫草中左旋紫草素的含量在0.05~1.47mg·g-1之間；β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧的含量在0.36~2.53mg·g-1之間；乙酰紫草素的含量在0.14~6.32mg·g-1之間；β,β-二甲基丙烯酰紫草素的含量在0.49~13.89mg·g-1之間。由此可見，不同產(chǎn)地的新疆紫草間4 種化學(xué)成分的含量差異較大。