王慧娟， 賈 婷， 朱萬龍， 王政昆

(1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點實驗室生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室， 昆明650500；2. 云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 昆明650106)

隨著高通量測序快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)成為篩選和定量分析差異表達(dá)基因的主要研究方法之一[1]，也涉及對小鼠等哺乳動物的脂肪、肌肉和肝臟研究[2]。

胰島素(insulin, INS)由胰腺β細(xì)胞合成和分泌，在調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、代謝，器官生長發(fā)育等方面發(fā)揮作用[3]。胰島素受體(insulin receptor, IR)由α、β兩個亞基組成，INS與IR結(jié)合導(dǎo)致IR酪氨酸激酶的激活和β亞基酪氨酸磷酸化，β亞基是酪氨酸磷酸化胰島素受體底物1/2(insulin receptor substrate, IRS1/2)的對接位點。IRS1/2對IR的募集激活兩個主要下游信號通路：磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路。PI3K信號通路的激活能促進(jìn)磷酸肌醇依賴激酶1(phosphoinositide dependent kinase-1, PDK1)磷酸化和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)的激活，進(jìn)而磷酸化叉頭盒蛋白O(forkhead box protein O, FOXO)和糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase, GSK-3β)等，在產(chǎn)熱、脂肪形成、糖原合成和蛋白質(zhì)合成等方面發(fā)揮作用[4]。MAPK級聯(lián)的激活是對胰島素調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞增殖、分化起關(guān)鍵作用[5]。

甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)對維持機體能量平衡、生長發(fā)育和增殖分化具有重要作用[6]。甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor, TR)主要分為TRα(如TRα1、TRα2)和TRβ(如TRβ1、TRβ2)兩個亞型，它們在組織發(fā)育、細(xì)胞生長和代謝中起作用[7]。TH對下游基因的調(diào)控機制可分為兩類：經(jīng)典的基因組途徑和非經(jīng)典的非基因組途徑[8]。前者是TH通過與TR結(jié)合，再與輔激活因子、輔抑制因子相互作用，刺激或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)能量平衡[9]。后者包括TH結(jié)合TR調(diào)節(jié)通路活性和TH與膜整合素受體相互作用。T3和TRβ結(jié)合調(diào)節(jié)PI3K信號通路活性，從而誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)；整合素αVβ3能同時激活PI3K通路和MAPK途徑[10]，這種細(xì)胞表面受體通過兩個位點(S1和S2)結(jié)合TH，能激活以上兩種通路[11]，在脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖分化等方面發(fā)揮作用。

脂肪組織根據(jù)其功能不同主要分兩大類：褐色脂肪(brown adipose tissue，BAT)和白色脂肪(white adipose tissue, WAT)[12]。WAT被經(jīng)典地認(rèn)為是一個主要的能量儲存庫，能量在體內(nèi)以脂質(zhì)的形式積累；而BAT在適應(yīng)性產(chǎn)熱過程中具有將多余能量轉(zhuǎn)化為熱量的顯著能力在冷暴露條件下，BAT大量產(chǎn)熱，維持機體體溫[13]。本研究組先前的研究表明冷馴化下中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)產(chǎn)熱增加，BAT質(zhì)量和解偶聯(lián)蛋白-1(uncoupling protein 1, UCP1)含量增加，以及脂肪轉(zhuǎn)化因子表達(dá)量等方面會發(fā)生變化[14]。

中緬樹鼩屬于攀鼩目(Scadentia)，樹鼩科(Tupaiidae)，樹鼩屬(Tupaia)，為攀鼩目在國內(nèi)僅有物種，熱帶、亞熱帶為主要分布區(qū)，在中國主要分布于云南、海南和貴州等地[15]。由于其與現(xiàn)生靈長類有較近的親緣關(guān)系，在生物醫(yī)學(xué)研究中作為人類代謝性疾病動物模型。先前冷馴化下中緬樹鼩的研究主要從個體水平、細(xì)胞水平、分子水平分析其冷適應(yīng)機制，而本文基于RNA-seq研究冷馴化條件下中緬樹鼩BAT中基因的差異表達(dá)，從而提供基因功能富集等相關(guān)信息，實現(xiàn)對基因功能的解析，對深入研究小型哺乳動物冷適應(yīng)對策具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究以成年健康的雄性中緬樹鼩為試驗對象，采集于云南省昆明市祿勸縣(25°25′～26°22′N，102°13′～102°57′ E，海拔1 679 m)。在云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物房飼養(yǎng)，室溫下適應(yīng)一個月，平均體重為(115.36±3.65) g，根據(jù)其體重分為兩組：對照組(n=6，溫度25 ℃±1 ℃)；冷馴化組(n=6，溫度5 ℃±1 ℃)，兩組均給予中等光照，水食自取，馴化28 d。馴化后用乙醚麻醉后將其處死，迅速取動物肩胛部的BAT，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

根據(jù)miRNeasy Mini Kit試劑盒說明書分別提取總RNA后檢測樣品。分別對12個個體進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建及文庫質(zhì)控，完成后選擇北京百邁客生物公司Illumina novaseq 6000測序平臺對文庫進(jìn)行測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理

為保證得到高質(zhì)量的Clean Data，需將測序所獲得的原始數(shù)據(jù)去除含有接頭和低質(zhì)量的讀長Reads，同時計算Q20，Q30值和堿基含量來控制測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。使用HISAT2將過濾后得到Clean reads與指定的基因組作為參考進(jìn)行序列比對，參考基因組來源于Ensembl數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址為(http://www.ensembl.org/Tupaia_belangeri/Info/Index?redirect=no)；再進(jìn)行文庫質(zhì)量評估；對樣本中表達(dá)的基因進(jìn)行歸一化處理后計算FPKM值，得到基因的表達(dá)量。

1.4 差異表達(dá)分析

根據(jù)對照組和冷馴化組間各樣品中基因的表達(dá)量篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)。篩選條件為差異倍數(shù)(fold change, FC)≥2，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)<0.01，其中FC表示兩樣品組間表達(dá)量的比值，而FDR是由差異顯著性P值校正后得到的。繪制差異表達(dá)基因火山圖和聚類圖。

1.5 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析

對差異表達(dá)基因做基因信息注釋，為了解差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，將差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)數(shù)據(jù)庫分析，以KS<0.01作為顯著性富集標(biāo)準(zhǔn)，篩選出3個分支顯著富集到GO term；為進(jìn)一步解讀基因功能，利用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)數(shù)據(jù)庫將差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，計算富集顯著性Q值(Q-value為多重假設(shè)檢驗校正之后的P-value)，找出顯著富集的pathways，并篩選出與胰島素和甲狀腺激素信號通路相關(guān)的差異基因。再結(jié)合FPKM值以及相關(guān)文獻(xiàn)的報道，篩選出關(guān)鍵基因。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序可靠性分析

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，選取5個DEGs進(jìn)行RT-PCR定量，內(nèi)參基因引物序列為F：GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC；R：CATCTGCTGGAAGGTGGACA，差異基因引物設(shè)計和實時定量操作步驟詳見文獻(xiàn)[14]，引物序列見表1。

表1 實時PCR定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)評估

各個樣本RNA總量>3 μg，完整度(RIN值)均≥7，樣本檢測合格。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表2，各樣品中Q30堿基百分比均不小于93.62%，GC含量均在50%左右，樣品間重復(fù)相關(guān)性良好，測序所得數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

表2 各樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計

2.2 差異表達(dá)分析

根據(jù)差異表達(dá)基因的FPKM值以及篩選標(biāo)準(zhǔn)，冷馴化組較對照組，共2 879個基因表達(dá)存在顯著差異，差異表達(dá)火山圖見圖1。與對照組相比，冷馴化組中有1 181個基因上調(diào)，1 698個基因下調(diào)。圖2顯示了2 879個差異表達(dá)基因在各樣品中的表達(dá)量，左側(cè)分支越接近說明基因表達(dá)量越接近。

2.3 差異表達(dá)基因的功能注釋和富集分析

將差異表達(dá)基因與COG、GO、KEGG、KOG、NR、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，統(tǒng)計注釋到的基因數(shù)量(表3)。GO注釋結(jié)果統(tǒng)計：細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程分別注釋到1 787、1 736和1 759個差異基因(圖3)；以富集條件KS<0.01為標(biāo)準(zhǔn)，KS值越小富集越顯著，細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過程分別富集到24、28和55個term，主要富集在生物學(xué)過程。表4列出了3個分支富集最顯著的前10個條目：“生物學(xué)過程”有5個與代謝過程相關(guān)(GO:0006695、GO:0055114、GO:0006658、GO:0006509、GO:0008299)，“細(xì)胞組分”包括細(xì)胞突觸和神經(jīng)元，“分子功能”包含催化活性和酶活性。

橫軸為log2(FC)，偏離0越遠(yuǎn)說明差異倍數(shù)越大；縱軸為-log10(FDR)，數(shù)值越大說明結(jié)果越可靠；紅點、綠點分別代表差異基因上調(diào)、下調(diào)，黑點則為無差異基因。圖1 差異表達(dá)火山圖Figure 1 Volcano plot of differentially expressed gene

每列代表一個樣本，每行代表一個基因，顏色代表了基因在樣品中的表達(dá)量水平log10(FPKM+0.000001)。圖2 差異表達(dá)基因聚類圖Figure 2 Analysis of differentially expressed genes

圖3 差異基因GO分類注釋統(tǒng)計Figure 3 GO annotation classification statistics of differential expression genes

表3 注釋的差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計表

表4 差異表達(dá)基因GO富集分析最顯著的前10條目

續(xù)表4(Continued Table 4)

通過KEGG注釋系統(tǒng)分析，本研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因參與細(xì)胞過程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、代謝(metabolism)、生物系統(tǒng)(organismal systems)等6大類以及47小類(圖4)；KEGG顯著富集到20條pathways，其中胰島素和甲狀腺激素信號通路差異表達(dá)基因的表達(dá)情況見圖5，在胰島素信號通路中篩選出的關(guān)鍵基因有PIK3CB、PIK3CD、PDPK1、AKT2、ACACA和SLC2A4等；甲狀腺激素信號通路中篩選出的關(guān)鍵基因有THRB、PIK3CB、PIK3CD和PDPK1等。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG分類圖Figure 4 KEGG classification map of differentially expressed genes

(a)胰島素信號通路；(b)甲狀腺激素信號通路。圖5 通路的DEGs和log2FCFigure 5 DEGs and log2FC were significantly enriched by thetwo pathways

2.4 測序結(jié)果可靠性

對5個DEGs進(jìn)行驗證，Real-time PCR與RNA-Seq比較結(jié)果見圖6，兩者之間的上下調(diào)表達(dá)趨勢一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量可靠。

圖6 RNA-Seq與 Real-time PCR結(jié)果比較Figure 6 Comparison of the RNA-Seq and Real-time PCR results

3 討論

胰島素信號通路主要參與調(diào)節(jié)機體的糖和脂肪代謝，INS激活PI3K通路會導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4(glucose transporter 4, GLUT4)從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面，促進(jìn)脂肪對葡萄糖攝取，從而抑制糖原合成[16-17]。PDK1和AKT都是絲/蘇氨酸激酶，屬于AGC蛋白激酶家族成員，脂肪細(xì)胞缺失PDK1可顯著抑制胰島素誘導(dǎo)的PKB/AKT的激活，從而抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT4的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位和葡萄糖的攝取[18]。Hosooka等[19]研究表明脂肪細(xì)胞特異性缺乏PDK1的小鼠，由胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取和脂肪生成被抑制。研究者采用shRNA方式抑制AKT2的表達(dá)阻礙了胰島素誘導(dǎo)的脂肪生成過程[20]。小鼠PKBβ基因座的靶向破壞導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中胰島素刺激的葡萄糖攝取受損[21]。本研究中，冷馴化組PDPK1和AKT2基因表達(dá)都顯著下調(diào)，說明中緬樹鼩可能通過下調(diào)PDPK1和AKT2的表達(dá)來抑制脂肪的生成和葡萄糖攝取，其中葡萄糖的攝取被抑制，從而促進(jìn)糖原的合成，為機體提供能量。溶質(zhì)載體家族2(soluate carrier family 2,SLC2A4)基因又稱GLUT4，據(jù)報道SLC2A4基因表達(dá)下降降低了脂肪組織對葡萄糖的吸收能力[22]。本研究冷馴化組SLC2A4基因表達(dá)顯著下調(diào)，說明中緬樹鼩可能通過下調(diào)SLC2A4基因的表達(dá)來抑制葡萄糖的吸收，從而促進(jìn)糖原的合成，為機體提供能量。

INS在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝時由PI3K通路中兩個主要轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)：固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1c(steriod response element binding protein-1c, SREBP-1c)和FoxO1，能決定乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase alpha,ACACA)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)等脂肪細(xì)胞特異性基因的轉(zhuǎn)錄活性[23-24]。ACACA活性和表達(dá)水平能夠調(diào)控脂肪酸的合成速度從而影響脂肪的沉積[25]。本研究中與對照組相比，冷馴化組編碼ACC和FAS的基因ACACA和Tupaia_belangeri_newGene_30753表達(dá)顯著下調(diào)，說明中緬樹鼩ACACA和Tupaia_belangeri_newGene_30753基因可能在調(diào)控脂肪合成方面發(fā)揮作用。FoxO1轉(zhuǎn)錄因子屬于叉頭盒O家族的重要成員，干擾FOXO1基因在脂肪細(xì)胞(前體細(xì)胞)中表達(dá)，抑制了脂肪細(xì)胞分化，從而阻礙脂肪生成[26-27]。本研究中編碼FoxO1的ENSTBEG00000011894基因下調(diào)，說明冷馴化下中緬樹鼩可能通過下調(diào)ENSTBEG00000011894基因來影響脂肪的分化和形成。

TH通過與TR結(jié)合的基因組作用能調(diào)節(jié)脂質(zhì)與能量代謝，與TRβ結(jié)合后能降低膽固醇[9]。TRβ1屬于核受體超家族成員，是由THRB基因編碼的[28]。Hashimoto等[29]證明TRβ突變的大鼠在甲狀腺素刺激下增強降膽固醇效應(yīng)，有研究表明小鼠脂肪前體細(xì)胞中膽固醇含量不足，最終為其他組織或器官提供能量來源[30]。本研究中冷馴化組THRB基因表達(dá)下調(diào)，說明中緬樹鼩BAT中膽固醇含量降低了，從而為體內(nèi)其他組織或器官提供能量來源。整合素αVβ3屬于整合素α鏈家族成員，有證據(jù)證實TH結(jié)合整合素αvβ3在ERK1/2信號通路中發(fā)揮了促血管生成作用[31]。整合素αV的表達(dá)與生存率具有相關(guān)性[32]。本研究中冷馴化組編碼整合素αVβ3的ENSTBEG00000015637基因下調(diào)，可能影響中緬樹鼩血管生成和生存，中緬樹鼩本就屬于熱帶區(qū)生存的動物，可能需要調(diào)控與存活有關(guān)的基因來應(yīng)對寒冷的環(huán)境。蛋白激酶A(protein kinase, PKA)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，編碼PKA的下調(diào)能抑制細(xì)胞的增殖[33]，本研究編碼PKA的蛋白激酶cAMP激活的催化亞基β(protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta,PRKACB)的下調(diào)可能導(dǎo)致冷馴化下中緬樹鼩細(xì)胞的增殖被抑制。研究表明PI3K抑制劑可減弱T3對脂肪酸合成酶mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)，從而減少脂肪的生成[34]。冷馴化組編碼PI3K的基因PPIK3CB、PIK3CD、ENSTBEG00000008364下調(diào)，說明中緬樹鼩可能通過下調(diào)PPIK3CB、PIK3CD、ENSTBEG00000008364基因減弱脂肪酸合成酶的表達(dá)，最終導(dǎo)致脂肪生成減少。Hashimoto等[29]研究表明，T3能通過激活PI3K通路調(diào)節(jié)SREBP-1c的表達(dá)，最終調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成。本研究中INS和TH都能通過激活PI3K通路調(diào)控SREBP-1c的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪的生成，說明冷馴化下中緬樹鼩BAT中INS和TH在脂質(zhì)代謝方面可能存在協(xié)同作用。胰島素與甲狀腺激素信號在脂質(zhì)合成代謝方面存在協(xié)同效應(yīng)[35]。

綜上表明，胰島素信號通路和甲狀腺激素信號通路在中緬樹鼩應(yīng)對寒冷環(huán)境過程中發(fā)揮重要作用，中緬樹鼩通過調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響能量代謝、生存、血管生成細(xì)胞增殖分化來應(yīng)對寒冷環(huán)境。