王露露, 陳 洲, 賈英民

(北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院， 北京100048)

AMPs是由12～50個氨基酸殘基組成的小生物分子，是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。AMPs具有分子量小、易溶于水、耐熱性強(qiáng)、抗菌譜廣和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[2-3]。AMPs 依據(jù)其來源的不同可分為動物源AMPs、植物源AMPs、微生物源AMPs和人源AMPs等，其中，動物是AMPs最主要的來源[4-5]，但動物源AMPs的提取和純化相當(dāng)復(fù)雜，限制了其生產(chǎn)應(yīng)用。而自1925年首次發(fā)現(xiàn)微生物源AMPs以來，微生物源AMPs憑借其生產(chǎn)周期短、成本低、操作簡單并易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)勢，逐漸凸顯出其應(yīng)用優(yōu)勢。

AMPs主要用于抗菌研究，包括抗細(xì)菌和抗真菌。研究表明，AMPs具有廣譜抗細(xì)菌活性，對G+菌或G-菌甚至兩類菌都具有殺傷作用。不同AMPs在抗菌活性方面存在較大差異，且抗菌譜也明顯不同。大多數(shù)AMPs對G+菌的抑制效果更為顯著，如短桿菌分泌的短桿菌肽S對G+菌的最小抑菌濃度MIC低于3 μg/mL，但對G-菌的MIC范圍則是3～12.5 μg/mL；多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的Fusaricidin A除對4種G+菌有抑制作用外，還對白色念珠菌等10株真菌有很強(qiáng)的抑制作用，其中對植物病原菌尖孢鐮刀菌的抑制作用最為顯著，MIC 為1.56 μg/mL，其次是黑曲霉、米曲霉和青霉菌，MIC均為3.12 μg/mL。隨著研究的深入，少數(shù)AMPs除具備較強(qiáng)的抗菌效果以外還表現(xiàn)出良好的抗腫瘤細(xì)胞、病毒和寄生蟲的活性。如枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的surfactin可抑制MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)、Hela(人宮頸癌細(xì)胞)和LoVo(人結(jié)腸癌細(xì)胞)的生長。同時surfactin還可以抑制偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus)、新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)和傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursa virus)的復(fù)制增殖以產(chǎn)生抗病毒作用。放線菌分泌的硫肽類AMPs GE2270可以抑制瘧原蟲的生長，其IC50值為0.1 μmol/L。近年來AMPs因其優(yōu)良的抗腫瘤特性逐漸被重視，更多科學(xué)家們便把精力投入到篩選具有良好抗腫瘤作用的新型AMPs的研究中，為實(shí)現(xiàn)AMPs在醫(yī)學(xué)方面的研究和應(yīng)用提供更多可能。本文重點(diǎn)圍繞微生物源AMPs的抗腫瘤特性進(jìn)行總結(jié)。

1 微生物AMPs抗腫瘤細(xì)胞特性的研究進(jìn)展

根據(jù)微生物種類的不同，AMPs分為3大類：一是細(xì)菌源AMPs；二是放線菌源AMPs；三是真菌源AMPs。其中，細(xì)菌源AMPs的抗腫瘤研究最多，而在細(xì)菌源AMPs中，又以芽孢桿菌屬AMPs的研究為主，乳酸菌屬AMPs次之。

1.1 細(xì)菌源AMPs

細(xì)菌源AMPs是由細(xì)菌代謝合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽。研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)菌源AMPs都能表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用(表1)。

1.1.1 來源于芽孢桿菌屬的AMPs

來源于芽孢桿菌屬的AMPs主要包括：納豆枯草芽孢桿菌TK-1產(chǎn)生的surfactin，納豆枯草芽孢桿菌T-2產(chǎn)生的CLP，海洋枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的Gageostatins A-C，藏豬腸道菌源性枯草芽孢桿菌TS產(chǎn)生的TP，短芽孢桿菌菌株SKDU10產(chǎn)生的Laterosporulin10(LS10)，側(cè)孢短芽孢桿菌 JX-5 產(chǎn)生的Bogorol B-JX(BBJX)，附生植物的芽孢桿菌產(chǎn)生的Baceridin，“深部類芽孢桿菌”的海洋沉積物菌株SL79的培養(yǎng)物中分離出的Heptapeptide，結(jié)構(gòu)類似于枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的桿菌霉素D的由淀粉樣芽孢桿菌fiply 3A產(chǎn)生的環(huán)狀脂肽，側(cè)孢芽孢桿菌產(chǎn)生的Spergualin(SGL)，海洋芽孢桿菌PKU-MA00093和PKU-MA00092產(chǎn)生的Bacillibactin， 及其類似物以及本課題組前期獲得由側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9產(chǎn)生的Brevilaterin。

以研究最廣泛的surfactin為例。曹小紅等[32]發(fā)現(xiàn)，surfactin對MCF-7、HepG2、LoVo、Raw264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)和U-937(人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞)有不同抑制作用，且surfactin還可誘導(dǎo)MCF-7和HepG2細(xì)胞發(fā)生胞質(zhì)濃縮、核崩解等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。此外，surfactin還可使MCF-7細(xì)胞的骨架發(fā)生劇烈變化。Kim等[6]發(fā)現(xiàn)surfactin還可通過阻斷細(xì)胞周期來抑制LoVo細(xì)胞的增殖。這也說明同一AMPs對不同腫瘤細(xì)胞有不同的抑制作用。Park等[7]發(fā)現(xiàn)surfactin還可以抑制對苯二甲酸(TPA)誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和 MDA-MB-231的侵襲、遷移。目前關(guān)于AMPs抑制腫瘤細(xì)胞的研究大都采用以上方法，但這些研究仍未指出明確的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，未能定位到具體的作用位點(diǎn)，所以有待更深入研究。

本課題組前期獲得一株側(cè)孢短芽孢桿菌S62-9能高效分泌AMPs(Brevilaterin)，Brevilaterin不僅對細(xì)菌和真菌均表現(xiàn)出廣譜抑制作用，還對多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抑制作用，如它能選擇性抑制人胃腺腫瘤細(xì)胞BGC-823的增殖(IC50為5～6 μg/mL)，但對相應(yīng)的人正常細(xì)胞(胃上皮細(xì)胞)的毒性卻很小。后期研究發(fā)現(xiàn)，Brevilaterin在IC50為1～20 μg/mL范圍內(nèi)，對人表皮癌細(xì)胞A431等20株腫瘤細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞HSF等10株人正常細(xì)胞有不同的抑制作用。研究還發(fā)現(xiàn)，Brevilaterin對A431細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，但同時又對HSF細(xì)胞有很小的毒性，這也為以后工作的開展奠定了基礎(chǔ)。以上研究證實(shí)Brevilaterin能夠選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞，但其抑制腫瘤細(xì)胞的機(jī)制尚不明確，這也是本實(shí)驗(yàn)室未來將要重點(diǎn)突破的工作之一。

1.1.2 來源于乳酸菌屬的AMPs

來源于乳酸菌屬的AMPs主要包括：乳酸鏈球菌產(chǎn)生的Nisin，植物乳桿菌C11產(chǎn)生的Plantaricin A(PlnA)和Plantaricin E(Pln E)，乳酸片球菌PAC1.0產(chǎn)生的Pediocin PA-1，乳酸片球菌產(chǎn)生的Pediocin K2a2-3，乳酸片球菌MTCC 5101產(chǎn)生的Pediocin CP2，沙克乳酸桿菌GM3產(chǎn)生的GM3。

表1 細(xì)菌源AMPs的抗腫瘤研究信息

續(xù)表1(Continued Table 1)

續(xù)表1(Continued Table 1)

目前，Nisin是乳酸菌屬來源的AMPs中研究最深入、應(yīng)用最廣泛的一種。如Nisin對MCF-7、HepG2、Vero(非洲綠猴腎細(xì)胞)、3種頭頸鱗狀癌細(xì)胞(UM-SCC-17B、UM-SCC-14A、HSC-3)、2種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(LS180、SW48)、HT29(人結(jié)腸癌細(xì)胞)和Caco2(人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞)均有不同的抑制作用。當(dāng)Nisin添加量高于IC50值時，MCF-7、HepG2、Vero的細(xì)胞質(zhì)便會出現(xiàn)收縮和空泡化、細(xì)胞核收縮偏向一側(cè)和細(xì)胞脫落等現(xiàn)象[33]。Nisin可通過改變鈣內(nèi)流和細(xì)胞周期，阻滯在G2期引起UM-SCC-17B、UM-SCC-14A、HSC-3細(xì)胞凋亡，且發(fā)現(xiàn)經(jīng)Nisin處理后的細(xì)胞中的CHAC1基因(一種陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子和凋亡調(diào)節(jié)因子)上調(diào)了4倍[18]。研究發(fā)現(xiàn)Nisin可通過下調(diào)CEA、CEAM6、MMP2F、MMP9F基因來抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移。以頭頸鱗狀腫瘤小鼠為模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Nisin處理后小鼠腫瘤體積明顯下降[34-35]。而Begde等[36]發(fā)現(xiàn)Nisin對Jurkat、Molt-4和培養(yǎng)的人類淋巴細(xì)胞在IC50為225 μmol/L時并未觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，說明其對腫瘤細(xì)胞的作用具有選擇性。Nisin目前主要被應(yīng)用在食品加工等領(lǐng)域，但更多關(guān)于它能抑制腫瘤細(xì)胞的研究被報道也為其潛在的抗腫瘤及臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1.1.3 來源于鏈球菌屬的AMPs

來源于鏈球菌屬的AMPs主要包括：肺炎鏈球菌產(chǎn)生的Pep27的類似物Pep27anal2，牛鏈球菌HC5產(chǎn)生的Bovicin HC5。

1.1.4 來源于其他細(xì)菌的AMPs

來源于其他細(xì)菌的AMPs主要包括：肺炎克雷伯桿菌KYC492產(chǎn)生的Microcin E492；綠膿桿菌42A產(chǎn)生的Pyocin S2；大腸桿菌產(chǎn)生的Colicins(A、E1、E3、U)；恥垢分枝桿菌14468產(chǎn)生的Smegmatocin 14468和糞腸球菌T136產(chǎn)生的Enterocin-A及Enterocin-B。

綜上所述，現(xiàn)已報道有抗腫瘤特性的細(xì)菌源AMPs主要來源于芽孢桿菌屬，其次為乳酸菌屬。它們的共同點(diǎn)是抑制腫瘤細(xì)胞的種類主要為人來源的腫瘤細(xì)胞，對不同的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定的選擇性，且都能使腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞皺縮等典型的凋亡現(xiàn)象。

1.2 放線菌源AMPs

放線菌源AMPs主要來源于鏈霉菌和微單胞菌，部分放線菌源AMPs也有一定的抗腫瘤作用。自1997年發(fā)現(xiàn)第一個由放線菌產(chǎn)生有抗腫瘤作用的AMPs——Thiocoraline以來，后來人們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了SW-163C、SW-163E、chaxapeptin 1和Sungsanpin(1)，但相比于細(xì)菌源AMPs，放線菌源AMPs的抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)較少且研究尚淺。

來源于鏈霉菌屬的AMPs主要包括：鏈霉菌屬(Streptomycesstrain SNJ013)產(chǎn)生的Sungsanpin(1)；列文虎克鏈霉菌C58株(S.leeuwenhoekiistrain C58)產(chǎn)生的chaxapeptin 1；鏈霉菌屬(Streptomycesstrain SNA15896)產(chǎn)生的SW-163C和E；來源于微單胞菌的AMPs為微單胞菌屬(Micromonospora)產(chǎn)生的Thiocoraline。

1.3 真菌源AMPs

真菌源AMPs在微生物源AMPs中占比較小，主要以木霉屬來源為主。Peptaibols類AMPs是一類由真菌合成的線性多肽分子，于1967年從綠色木霉(Trichodermaviride)培養(yǎng)物中分離得到?？祵幟顾?Trichokonins，TKs)則是康寧木霉(Trichodermakoningii)的次生代謝產(chǎn)物，屬于Peptaibols類抗菌肽。研究發(fā)現(xiàn)Peptaibols類AMPs還具有良好的抗腫瘤作用[37]。

TrichokoninⅥ是由康寧木霉SMF2株產(chǎn)生的AMPs之一。研究發(fā)現(xiàn)TrichokoninⅥ對A549、HepG2和BGC-823細(xì)胞有不同的抑制作用且細(xì)胞表現(xiàn)出不同的形態(tài)變化，且可使HepG2細(xì)胞進(jìn)入一種caspase依賴性的新型paraptosis(副凋亡)程序性細(xì)胞死亡過程，其副凋亡作用主要表現(xiàn)在未見凋亡小體的形成，但胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高，相關(guān)凋亡蛋白和酶發(fā)生變化。TrichokoninⅥ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有paraptosis的一些特征，如：細(xì)胞大量死亡、線粒體破壞、以及胞質(zhì)不均質(zhì)化并伴有大量空泡的形成，不形成凋亡小體等典型的凋亡特征。同時，TrichokoninⅥ還可形成跨膜Ca2+通道，使胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高。TrichokoninⅥ可使抗凋亡蛋白Bax-xl的表達(dá)水平下降，而caspase-9前體剪切為活性形式，同時，caspase下游底物PARP也被激活，且其對細(xì)胞的生長抑制作用可被caspase特異性抑制劑z-VAD-fmk所抑制[38]。

王紅娜[39]發(fā)現(xiàn)TrichokoninⅥ不僅可使A549和HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，還可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，并以A549細(xì)胞為對象研究其凋亡與自噬機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其凋亡與自噬性死亡過程均不依賴于caspase活性，線粒體完整性在此過程中被破壞。在死亡過程中，A549細(xì)胞線粒體膜電位去極化，細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)增多，抗凋亡蛋白Bcl-xl表達(dá)水平下降，促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平上升。

AMPs抑制腫瘤細(xì)胞大都會啟動caspase機(jī)制，但TrichokoninⅥ的研究發(fā)現(xiàn)其凋亡與自噬性死亡過程均不依賴于caspase活性，這也為以后的研究提供了新思路。

2 微生物源AMPs抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展

隨著學(xué)者們對AMPs抗腫瘤細(xì)胞研究的深入，人們對其抗腫瘤機(jī)制的認(rèn)識也逐步提高，近年來研究重點(diǎn)延伸到AMPs抗腫瘤機(jī)制。AMPs抑殺腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要分為兩種：一種是AMPs直接接觸腫瘤細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜、線粒體、核膜、細(xì)胞核染色體、細(xì)胞骨架和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等以抑制或殺死腫瘤細(xì)胞；另一種是AMPs通過積極調(diào)動和增強(qiáng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來識別和殺傷腫瘤細(xì)胞[40]。此外，極少數(shù)AMPs還具有獨(dú)特的抗腫瘤作用機(jī)制，如新型副凋亡程序性細(xì)胞死亡機(jī)制[41]。但參考目前國內(nèi)外對抗腫瘤藥物的研究經(jīng)驗(yàn)，學(xué)者們也把AMPs抗腫瘤細(xì)胞機(jī)制的側(cè)重點(diǎn)定位于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，受多種基因精確調(diào)控的主動的、程序化的死亡過程，是機(jī)體重要的自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制[42]。近年來，大量研究證明，細(xì)胞凋亡通常是通過兩個進(jìn)化保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的(表2)：胞外途徑為死亡受體途徑；胞內(nèi)途徑為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑。

表2 微生物源AMPs誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑

(1)死亡受體途徑，指細(xì)胞膜表面的特定蛋白質(zhì)能與攜帶凋亡信號的專一性配基結(jié)合，并將凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡信號的傳導(dǎo)在此通路中依賴于死亡配體與受體的特異性結(jié)合以及受體死亡結(jié)構(gòu)域與信號傳導(dǎo)分子結(jié)合。其中死亡結(jié)構(gòu)域是指死亡受體家族的胞內(nèi)部分所含的約80個氨基酸殘基組成的介導(dǎo)凋亡區(qū)域。該結(jié)構(gòu)域可將胞外信號傳遞到胞內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)凋亡。目前已知的死亡受體有8種，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有3條，分別為TNFR、TRAIL和Fas/FasL信號途徑[46-47]。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對鈣離子的調(diào)控，或是凋亡酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上激活死亡受體，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放，從而使線粒體分裂，誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡，也有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是線粒體途徑的補(bǔ)充。線粒體途徑是目前研究最多的，線粒體在凋亡機(jī)制中承擔(dān)著調(diào)控者的地位，其中Cyt C也起到了關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過各種促凋亡刺激均可引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而開放，進(jìn)而使線粒體膜的通透性增加，最終Cyt C和凋亡誘導(dǎo)因子等蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Cyt C自線粒體釋放后，在ATP或dATP的共同作用下形成多聚復(fù)合物，從而啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[46]。Surfactin、CLP、Brevilaterin、BBJX、Nisin ZP和Microcin E492均是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，越來越多微生物源AMPs被發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤細(xì)胞的作用，其中以細(xì)菌源AMPs研究最多，放線菌源和真菌源AMPs的研究較少；細(xì)菌源AMPs 中以芽孢桿菌源AMPs研究較多且抗腫瘤效果較好。不同微生物源AMPs可抑制腫瘤細(xì)胞的種類及能力各不相同，它們可抑制人源腫瘤細(xì)胞、動物源腫瘤細(xì)胞和病毒轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞。其中，研究較多且較深入的是對人源腫瘤細(xì)胞的抗性研究，如對發(fā)病率較高的胃癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞等，這也是本課題組研究選用人源腫瘤細(xì)胞的依據(jù)。微生物源AMPs獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制以及在細(xì)胞選擇性和耐藥性方面的優(yōu)勢，使其在抗腫瘤方面有良好的應(yīng)用前景。隨著各種新技術(shù)不斷涌現(xiàn)以及AMPs理論和應(yīng)用研究不斷深入，AMPs有望在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。

圖1 微生物源AMPs常見抗腫瘤機(jī)理[48]Figure 1 Common anti-tumor mechanism of microbial AMPs[48]

雖然微生物源AMPs在抗腫瘤研究方面凸顯出很多優(yōu)勢，但其要從實(shí)驗(yàn)研究走向?qū)嶋H應(yīng)用還需解決很多問題。(1)現(xiàn)有AMPs抗腫瘤細(xì)胞的效果并不理想，還需要繼續(xù)尋找抑制效果更好的AMPs，而且真菌和放線菌源AMPs的研究較少，可根據(jù)已有真菌和放線菌源AMPs的篩選方法繼續(xù)尋找更多AMPs新資源。(2)迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的抗菌肽誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的常見機(jī)理(圖1)，但誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的許多機(jī)理仍未被研究透徹，如細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)基因的定位、凋亡精確的生化機(jī)制及其不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控等都需要進(jìn)一步探索。(3)目前AMPs抗腫瘤細(xì)胞的研究大多集中體外研究，而體內(nèi)和臨床的嘗試還很少，且其藥效、藥理及對人體的影響也不清楚，可以針對部分抗腫瘤效果良好的AMPs資源作出進(jìn)一步臨床研究。