張 偉，劉 暢，杜國棟，汪曉謙

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 110866）（2 遼寧省果樹科學(xué)研究所）

南果梨（Pyrus ussuriensisMaxim.）作為秋子梨系統(tǒng)中的優(yōu)良品種，具有果實(shí)香氣濃郁，抗寒力強(qiáng)等特點(diǎn)，在遼寧省鞍山、遼陽等地區(qū)大面積栽培。但因其果實(shí)石細(xì)胞較多，嚴(yán)重影響了果實(shí)品質(zhì)[1]。石細(xì)胞是梨果實(shí)發(fā)育過程中形成的一類特殊結(jié)構(gòu)物質(zhì)，由薄壁組織細(xì)胞在其初生壁上沉積木質(zhì)素等而形成，其數(shù)目、大小、密度等對(duì)梨果實(shí)食用品質(zhì)有明顯的影響[2]。木質(zhì)素的聚合過程是石細(xì)胞發(fā)育過程的關(guān)鍵點(diǎn)，鈣素可能在這一過程中起著關(guān)鍵作用[3]。鈣作為植物生長所必需的營養(yǎng)元素之一，與細(xì)胞壁的代謝和發(fā)育過程關(guān)系密切，對(duì)保持果實(shí)細(xì)胞壁的完整性和延緩果實(shí)的衰老有重要意義[4]。李疆等[5]報(bào)道，葉面噴鈣可以降低庫爾勒香梨石細(xì)胞的大小、密度和含量，對(duì)其他果實(shí)品質(zhì)也有積極影響。沙守峰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在早金酥梨樹生長季節(jié)葉面噴施鈣肥，可顯著提高果實(shí)糖酸比，效果明顯。汪曉謙等[7]研究表明，PBO＋鈣硼合劑處理可以提高南果梨脫萼率，降低石細(xì)胞含量，對(duì)果實(shí)品質(zhì)有明顯的提升。

此外，鈣作為細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的第二信使，能夠參與植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞對(duì)各種脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[8]。生產(chǎn)中，很多不良環(huán)境條件都會(huì)導(dǎo)致梨石細(xì)胞含量增多、果實(shí)品質(zhì)下降，比如低溫、營養(yǎng)不足等，而這些環(huán)境因素都與鈣離子存在聯(lián)系。因此，篩選合理的外源鈣肥處理，可為梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供具體的果實(shí)品質(zhì)提升調(diào)控技術(shù)措施，對(duì)于梨優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)有重要意義。目前，有關(guān)鈣肥對(duì)梨果品質(zhì)的研究報(bào)道較多，但缺乏對(duì)石細(xì)胞形成過程中木質(zhì)素代謝的影響機(jī)制研究，且針對(duì)南果梨的研究較少。本研究以南果梨為材料，通過不同時(shí)期噴施不同形態(tài)、不同濃度的外源鈣肥，分析其對(duì)果實(shí)品質(zhì)、石細(xì)胞含量及木質(zhì)素代謝的影響，可為南果梨的果實(shí)品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇生長健壯、樹勢一致、能夠正常開花結(jié)果的南果梨樹作為試驗(yàn)材料，樹形為基部三主枝疏散分層形，樹體花量中等且生長狀況良好，每個(gè)花序留果2 個(gè)，供試材料定植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基地，并按照常規(guī)栽培措施管理。外源鈣肥為氯化鈣（國藥集團(tuán)）和糖醇螯合鈣（連云港福隆農(nóng)業(yè)公司，Ca≥180 g/L）。

1.2 試驗(yàn)方法

分別于盛花期、盛花期后20 d 噴施不同濃度的氯化鈣（2.5、5.0 g/L）及糖醇螯合鈣（1 000、2 000倍液）溶液，以噴清水為對(duì)照（CK），共9 個(gè)處理（表1），每處理3 次重復(fù)，噴施花序部位及幼果，以藥劑附著并滴落為止。分別于花后30、60、90、120、150 d 取樣，每次隨機(jī)選取果實(shí)15 個(gè)，測定其基本品質(zhì)指標(biāo)，其余果肉于-80 ℃冰箱中保存。

表1 試驗(yàn)處理

1.3 測定指標(biāo)及方法

單果重使用電子天平（E5500S，Sartorius，德國）進(jìn)行稱量；果實(shí)橫縱徑采用電子游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量，并計(jì)算果形指數(shù)；可溶性固形物含量使用阿貝折光儀PAL-1（Atago，日本）進(jìn)行測定；果實(shí)硬度使用果實(shí)硬度計(jì)測定；石細(xì)胞含量的測定采用鹽酸處理法，具體參考Lee 等[9]的方法；總鈣含量的測定采用火焰原子吸收分光光度法，具體參考于會(huì)麗等[10]的方法。

木質(zhì)素代謝相關(guān)基因表達(dá)分析使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 7500 Real-Time）進(jìn)行，使用ddCT 法進(jìn)行結(jié)果分析。所用引物使用Primer 3 進(jìn)行設(shè)計(jì)，序列如表2 所示。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量所用引物

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和處理，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Sigma Plot 10.0 版作圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施鈣肥對(duì)南果梨果實(shí)品質(zhì)的影響

由表3 可知，分別于盛花期和盛花期后20 d 噴施不同鈣肥，對(duì)南果梨果實(shí)品質(zhì)均有顯著影響。鈣處理后，南果梨單果重顯著高于對(duì)照。除T8 處理外，其他處理的果實(shí)橫徑均顯著高于對(duì)照。T1、T3、T4、T5、T6、T7 處理的果實(shí)縱徑分別為55.15、55.93、59.75、54.89、55.40、58.73 mm，均顯著高于對(duì)照，其他處理與對(duì)照差異不顯著。經(jīng)過鈣肥處理后，可溶性固形物含量與對(duì)照相比差異均不顯著。T2、T4、T7 處理的果實(shí)硬度分別為16.16、16.79、16.20 kg/cm2，均顯著高于對(duì)照，其他處理與對(duì)照相比差異不顯著。從整體上看，噴施外源鈣肥對(duì)南果梨果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)有所改善，不同程度上提高了南果梨的單果重。

表3 噴施鈣肥對(duì)南果梨成熟期果實(shí)品質(zhì)的影響

2.2 噴施鈣肥對(duì)南果梨鈣含量動(dòng)態(tài)變化的影響

由表4 可以看出，隨著南果梨的發(fā)育，果實(shí)總鈣含量逐漸下降。而經(jīng)過不同鈣肥處理的南果梨的總鈣含量均高于對(duì)照，其中花后30 d 時(shí)，T1、T6處理的總鈣含量較高，分別為739.98、764.41 μg/g；而花后150 d 時(shí)，除T1 處理外，其他處理的總鈣含量均顯著高于對(duì)照。這表明，外源鈣肥處理可顯著提升南果梨果實(shí)總鈣含量，其中T6 處理效果較好。

表4 噴施不同鈣肥后南果梨果實(shí)總鈣含量變化

2.3 噴施鈣肥對(duì)南果梨石細(xì)胞含量動(dòng)態(tài)變化的影響

由表5 可以看出，南果梨石細(xì)胞含量隨果實(shí)生長發(fā)育逐漸下降，部分鈣肥處理對(duì)石細(xì)胞含量有顯著的影響。其中，花后90、120 d，不同鈣肥處理均降低了果實(shí)石細(xì)胞含量，而花后150 d，T1、T5、T6、T8 處理的石細(xì)胞含量均顯著低于對(duì)照。這說明，不同鈣肥對(duì)梨果實(shí)石細(xì)胞的形成有不同程度的抑制作用，部分處理的效果顯著，可有效降低果實(shí)石細(xì)胞含量。

表5 噴施不同鈣肥后南果梨果實(shí)石細(xì)胞含量變化

2.4 氯化鈣處理對(duì)南果梨木質(zhì)素代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇效果較好的T6（盛花期后20 d 噴施5.0 g/L 氯化鈣）處理，進(jìn)一步分析鈣肥處理對(duì)木質(zhì)素代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。花后30 d 為果實(shí)木質(zhì)素合成的高峰期，如圖1 所示，鈣肥處理顯著降低了該時(shí)期果肉中PuC3H、PuCAD、PuPOD、PuLAC基因的表達(dá)水平，顯著提高了PuHCT、PuCCoAOMT、PuF5H基因的表達(dá)水平，而對(duì)PuPAL、PuC4H、PuCCR基因表達(dá)的影響不顯著。這說明鈣肥處理可能通過降低PuC3H、PuCAD、PuPOD、PuLAC基因的表達(dá)水平，從而抑制了南果梨木質(zhì)素的合成和聚合，減少了木質(zhì)素的積累。

圖1 氯化鈣處理對(duì)南果梨木質(zhì)素代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

鈣在植物體生長發(fā)育過程中起到重要作用，是果樹所必需的營養(yǎng)元素，它作為第二信號(hào)系統(tǒng)，直接參與植物體代謝反應(yīng)，對(duì)植物生長發(fā)育起重要作用。本研究通過噴施不同濃度的氯化鈣（2.5、5.0 g/L）及糖醇螯合鈣（1 000、2 000 倍液）溶液，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，鈣肥處理可使南果梨的果實(shí)品質(zhì)得到有效提升。闞超楠等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)翠冠梨噴施2.0%氯化鈣后果實(shí)硬度、可溶性糖含量等果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)均有所提升。張峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過噴施鈣肥提高了庫爾勒香梨的單果重、可溶性固形物含量及果實(shí)硬度等指標(biāo)。黃艷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，通過噴施鈣肥可顯著提高夏黑葡萄的果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量等指標(biāo)。本研究與前人研究結(jié)果一致，經(jīng)過鈣肥處理的南果梨果實(shí)鈣含量明顯高于對(duì)照，證明了外源鈣處理可有效補(bǔ)充南果梨果實(shí)鈣含量，并對(duì)果實(shí)品質(zhì)提升有積極作用。不同鈣肥處理的效果存在差異，可能與其有效鈣含量差異有關(guān)。

梨果實(shí)中石細(xì)胞含量會(huì)直接影響其品質(zhì)，石細(xì)胞積累增加會(huì)導(dǎo)致口感下降[14]。石細(xì)胞來源于木質(zhì)素的合成與沉積，其含量與木質(zhì)素代謝直接相關(guān)[15]。外源噴施CaCl2可以使庫爾勒香梨果實(shí)石細(xì)胞含量降低，對(duì)梨果實(shí)石細(xì)胞代謝產(chǎn)生重要的影響[16]。在萊陽茌梨中，也發(fā)現(xiàn)葉面噴施CaCl2可降低石細(xì)胞的含量[17]。本研究中，不同外源鈣肥均對(duì)南果梨石細(xì)胞含量產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，部分處理的石細(xì)胞含量在不同時(shí)期中均顯著低于對(duì)照，可為探索石細(xì)胞調(diào)控技術(shù)提供參考。

木質(zhì)素代謝途徑是苯丙烷代謝途徑的分支，合成的木質(zhì)素單體經(jīng)聚合形成木質(zhì)素。研究表明，木質(zhì)素積累通常與木質(zhì)素代謝相關(guān)基因的表達(dá)存在相關(guān)性[18]。本研究對(duì)鈣肥處理后10 個(gè)木質(zhì)素相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)PuC3H、PuCAD、PuPOD、PuLAC等基因在氯化鈣處理后表達(dá)量顯著下降，與石細(xì)胞含量變化一致。這與已有的部分研究也是一致的，鈣處理對(duì)肉桂醇脫氫酶（CAD）、過氧化物酶（POD）等酶活性有抑制作用[17,19]。CAD是催化木質(zhì)素單體生物下游合成的關(guān)鍵酶，而POD和漆酶（LAC）則參與木質(zhì)素單體的聚合過程[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鈣肥處理后PuCAD、PuPOD、PuLAC等木質(zhì)素代謝的下游關(guān)鍵基因在石細(xì)胞形成的關(guān)鍵時(shí)期被顯著抑制，可能是外源鈣降低石細(xì)胞積累的主要原因。另一方面，部分基因（PuHCT、PuF5H、PuCCoAOMT）在氯化鈣處理后出現(xiàn)表達(dá)量顯著升高的現(xiàn)象。PuHCT、PuC3H、PuF5H、PuCCoAOMT均屬于木質(zhì)素合成途徑的中游基因，對(duì)于G 型和S 型木質(zhì)素單體的組成比例有重要作用，但對(duì)木質(zhì)素總量影響較小[21]。因此，這可能與鈣處理對(duì)木質(zhì)素單體組成產(chǎn)生影響有關(guān)，其作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究于不同時(shí)期對(duì)南果梨噴施不同濃度的氯化鈣和糖醇螯合鈣溶液，發(fā)現(xiàn)不同鈣處理對(duì)南果梨果實(shí)品質(zhì)及石細(xì)胞含量均有不同程度的調(diào)節(jié)作用。其中，盛花期后20 d 噴施5.0 g/L 氯化鈣處理可顯著增加南果梨單果重和橫縱徑，提高果實(shí)總鈣含量，同時(shí)有效降低石細(xì)胞含量，綜合效果較好。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，氯化鈣處理降低了南果梨果實(shí)木質(zhì)素代謝相關(guān)合成基因PuC3H、PuCAD、PuPOD、PuLAC的表達(dá)水平，可能是外源鈣降低石細(xì)胞積累的主要原因，具體機(jī)制亟待進(jìn)一步的研究。