周 楠，蔣林惠，石 敏，楊 俊，袁琛凱，周易枚

南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心 (南通 226000)

黃曲霉毒素是生長在植物種子及食物、飼料中的黃曲霉和寄生曲霉代謝的產(chǎn)物，在天然污染中以黃曲霉毒素B1最為多見[1-3]。黃曲霉毒素B1(AFT B1)毒性及致癌性極強(qiáng)，且耐熱，分解溫度為268 ℃左右，一般烹調(diào)加工破壞很少，攝入AFT B1后出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，表現(xiàn)為免疫力降低，肝、脾和腎等器官損傷，有強(qiáng)致突變性和強(qiáng)致癌性[4-6]。我國根據(jù)不同的食品類別也制定了相應(yīng)的 AFT B1食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，其中花生油和玉米油AFT B1限量為20 μg/kg，其它植物油脂中限量為10 μg/kg[7-8]?？焖俸?jiǎn)單的AFT B1的檢測(cè)方法對(duì)于保障糧油安全顯得尤為重要。

AFT B1的檢測(cè)方法主要包括：同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-13]、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法[14-16]、酶聯(lián)免疫吸附篩查法[17-19]等等。其中同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法由于其回收率高，且避免基質(zhì)背景干擾，是目前最常見的檢測(cè)方法[20-21]。但液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法對(duì)上機(jī)樣液要求較高，因此需要凈化提取樣品中的AFT B1，目前最常見的凈化提取方法為免疫親和柱凈化提取法。隨著復(fù)合型快速凈化柱的問世，凈化柱法也逐漸得到重視和應(yīng)用。

本文采用免疫親和柱-同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以及快速凈化柱-同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)植物中黃曲霉毒素B1進(jìn)行了檢出限、加標(biāo)回收率等實(shí)驗(yàn)比對(duì)，分析了兩種方法特點(diǎn)和適用條件。

1 材料與方法

1.1 主要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及試劑

黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)，0.511 μg/mL,ANPLE公司)；黃曲霉毒素B1，100.2 μg/mL,阿爾塔公司；乙腈，色譜純, Merck公司；甲醇，色譜純,Merck公司；乙酸，分析純,中國國藥集團(tuán)；TritionX-100，化學(xué)純,中國國藥集團(tuán)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

免疫親和柱(上海安普實(shí)驗(yàn)室科技有限公司)、復(fù)合快速凈化柱(ROMER LAB)，液質(zhì)聯(lián)用儀(Therme Fisher，TSQ-ALTIS)、離心機(jī)(Hettich，MIKRO 220R)、渦旋混合儀(ESSENSCIEN，VM-2500)、電子天平(Sartorius、 CPA225D)、氮吹儀(Horizon，Xcelvap)。

1.3 方法

1.3.1樣品前處理

1.3.1.1 快速凈化柱凈化法

在50 mL離心管中稱取5 g樣品，加入同位素內(nèi)標(biāo)(100 ng/mL)100 μL后, 靜置30 min。加入20 mL乙腈-水(85∶15,v/v)混合溶液，渦旋20 min，6 000 r/min離心5 min。在10 mL玻璃管中加入70 μL乙酸，取7 mL上清液加入玻璃管中，渦旋混勻，將填充凈化柱的襯管推入裝有樣品上清液的玻璃外管，使得玻璃外管中樣品上清液緩慢通過凈化柱壓入襯管，在襯管中取4 mL凈化液于氮吹管中，50 ℃氮吹近干，用1 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.1.2 免疫親和柱凈化法

稱取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液(100 ng/mL)振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 mL乙腈-水溶液(85:15,v/v),渦旋混勻15 min，在6 000 r/min下離心10 min，取上清液備用。準(zhǔn)確移取4 mL上清液,加入46 mL 1% TritionX-100的PBS(磷酸鹽緩沖溶液)混勻。

將免疫親和柱恢復(fù)至室溫，待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后, 將上述樣液移至50 mL注射器筒中,調(diào)節(jié)下滴速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后加入2×10 mL水淋洗。用真空泵抽干親和柱。加入2×1 mL甲醇洗脫親和柱,收集全部洗脫液至試管中。在50 ℃下用氮吹至近干，加入1.0 mL初始流動(dòng)相，渦旋30 s溶解殘留物,0.22 μm濾膜過濾,收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:準(zhǔn)確移取AFT B1標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL) 5 μL、10 μL、50 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL、2 000 μL、5 000 μL至10 mL容量瓶中,加入200 μL 100 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液,用初始流動(dòng)相定容至刻度,配制濃度點(diǎn)為0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。AFT B1內(nèi)標(biāo)濃度為2 ng/mL。

1.3.3空白樣品加標(biāo)

稱取陰性空白樣品24份，每份稱樣質(zhì)量5.0 g，分四濃度水平加標(biāo)(編號(hào)1～24)。加標(biāo)濃度分別為0.1 μg/kg 、1 μg/kg、 10 μg/kg、20 μg/kg。每個(gè)濃度水平加標(biāo)6份空白樣品，其中3份前處理過程參照快速凈化柱凈化法，另外3份前處理過程參照免疫親和柱凈化法。

1.4 儀器條件

1.4.1液相色譜條件

色譜柱，Accucore RPMS C18柱，150 mm×2.1mm,2.6 μm；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；柱溫35 ℃。流動(dòng)相A相：5 mmol/L乙酸銨溶液；流動(dòng)相B相：乙腈-甲醇(50∶50,v/v)；梯度：35% B(0 ～0.5 min)，45% B(3～4 min)， 100% B(4.2～4.8 min)，32% B(5.0～7.0 min)。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧；噴霧電壓3 500 V；離子源溫度400 ℃；離子管傳輸溫度320 ℃；檢測(cè)方式，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)；鞘氣35 Arb、輔助氣8 Arb、吹掃氣0 Arb；均為高純氮?dú)狻?/p>

黃曲霉毒素B1(AFT B1)：定量離子對(duì)(m/z)為313/285；透鏡電壓(V)為73；碰撞能量(eV)為23.57；定性離子對(duì)(m/z)為313/241，透鏡電壓(V)為73，碰撞能量(eV)為37.71。黃曲霉內(nèi)標(biāo)B113C17-AFT B1：定量離子對(duì)(m/z)為330/255；透鏡電壓(V)為91；碰撞能量(eV)為39.53；定性離子對(duì)(m/z)為330/301，透鏡電壓(V)為91，碰撞能量(eV)為24.29。

2 結(jié)果與討論

2.1 快速凈化柱凈化法提取劑優(yōu)化

本文采用乙腈-水(85∶15,v/v)、乙腈-水(70∶30,v/v)、乙腈-水(50∶50,v/v)、甲醇-水(85∶15,v/v)、甲醇-水(70∶30,v/v)、甲醇-水(50∶50,v/v)作為提取劑，用快速柱凈化法處理1 μg/kg的加標(biāo)樣品中，渦旋震搖15 min，其余前處理操作按照1.3.1.1進(jìn)行，回收率結(jié)果如圖1。

圖1 提取劑類型與配比對(duì)回收率的影響

由圖1可見，同樣濃度配比的乙腈-水溶液提取效果優(yōu)于甲醇-水，且有機(jī)相比例高，有利于黃曲霉毒素B1的提取。本文選擇了乙腈-水混合液(85∶15，v/v)作為提取劑。

2.2 檢出限及線性范圍測(cè)定結(jié)果對(duì)比

由于兩種前處理方法標(biāo)準(zhǔn)曲線都是內(nèi)標(biāo)物質(zhì)參與的試劑曲線，其配制過程一致，檢測(cè)儀器一致，因此其線性范圍、線性方程及其相關(guān)系數(shù)都是一致的。檢出限通過向空白樣品中加標(biāo)，經(jīng)前處理步驟后上機(jī)測(cè)定，根據(jù)其響應(yīng)信噪比(S/N)≥3確定。由表1可以看出,凈化柱處理法檢出限略低于免疫親和柱處理法，該法檢測(cè)靈敏度更好。

表1 兩種檢測(cè)方法的工作曲線及檢出限

2.3 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

通過對(duì)空白樣品四水平加標(biāo)(n=3)進(jìn)行回收率比對(duì)(結(jié)果見表2)。由表2可見，凈化柱法平均回收率范圍在86.0%～105.0%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.6%～15.1%。免疫親和柱處理法平均回收率范圍為 88.0%～96.9%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.3%～9.1%。

2.4 質(zhì)控樣品的定值測(cè)定t值檢驗(yàn)

3 結(jié)論

本文對(duì)免疫親和柱-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、快速凈化柱凈化-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物油中AFT B1方法比對(duì)分析。實(shí)驗(yàn)表明兩種方法均能夠較好的進(jìn)行定量分析。快速凈化柱處理法檢出限較低，適合于低含量樣品檢測(cè)，且處理方法簡(jiǎn)單快捷，使用試劑少、避免繁瑣的試劑配制過程，適合大批樣品批量化處理。免疫親和柱前處理法步驟復(fù)雜，其加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果回收率較快速凈化柱凈化法略高，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差略小，可見該前處理方法準(zhǔn)確定性和穩(wěn)定性較好，適合于較低含量樣品的檢測(cè)，但不適合大批量樣品檢測(cè)。用t值檢驗(yàn)法對(duì)兩種前處理測(cè)定質(zhì)控樣品植物油黃曲霉毒素B1結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩種處理方法對(duì)于測(cè)定植物油中的黃曲霉毒素B1具有良好的一致性，說明兩種前處理方法準(zhǔn)確度較高。綜上所述，快速柱凈化法可以應(yīng)用于大批量植物油樣品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。

表2 凈化柱處理-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和免疫親和柱處理-同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃曲霉B1 的回收率和精密度(n=3)

表3 兩種前處理方法測(cè)定AFT B1質(zhì)控樣品結(jié)果