付莉媛，蔡瑞杰，馮志敏，宋新娜,，朱英波，史鳳玉,3，劉建斌

（1. 河北科技師范學院農(nóng)學與生物科技學院，昌黎 066004；2. 北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，北京 100097；3. 河北科技師范學院河北省作物逆境生物學重點實驗室（籌），秦皇島 066000）

葡萄是世界上廣泛種植的水果之一，由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的灰霉病是葡萄主要病害，嚴重影響葡萄果實的品質(zhì)和產(chǎn)量[1,2]?；移咸焰咴谧匀粭l件下即可侵染葡萄植株，造成灰霉病的大量發(fā)生，一般造成的經(jīng)濟損失在5%～20%，嚴重時可達80%以上，甚至毀棚，給種植戶帶來巨大經(jīng)濟損失[3]。

目前，我國對葡萄灰霉病的控制多以化學藥劑防治為主，常用的化學藥劑主要有丙烷脒、多菌靈、噻菌靈和腐霉利等，均有較好的抑制效果[4]。然而，化學藥劑不當使用不僅會造成嚴重的環(huán)境污染，同時也會增加病原菌的抗藥性，導致防治效果降低[5,6]。生物防治具有安全性高、無污染，不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是目前最有應(yīng)用前景的防治方法。多年來，關(guān)于利用生防菌控制灰霉病的研究已有較多報道，如Eald等[7]、童蘊慧等[8]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉、綠色木霉具有防治葡萄灰霉病的效果[9]。荊卓瓊[10]、葉濤等[11]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌對番茄灰霉病有很好的抑制作用。

但以葡萄灰霉病為靶標的生防芽胞桿菌的篩選與研究相對較少，本研究以灰葡萄孢菌為靶標病原菌，從健康葡萄根際土壤進行分離、篩選生防菌，通過對峙法篩選出對灰葡萄孢菌有抑制作用的生防芽胞桿菌，并制成生物菌肥，通過田間試驗評價其對葡萄灰霉病的防治效果，以期為葡萄灰霉病的生物防治提供理論依據(jù)和應(yīng)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土壤樣品采集自我國新疆、山東以及河北等葡萄主產(chǎn)區(qū)的葡萄根際土壤（0～20 cm）及健康新鮮的葡萄葉片備用。

供試牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（用于芽胞桿菌分離和培養(yǎng)）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水定容至1000 mL。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，去離子水定容至1000 mL。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（用于葡萄灰霉病原菌培養(yǎng)）：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，去離子水定容至1000 mL。

供試灰葡萄孢菌Botrytis cinerea由北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所微生物科學實驗室分離保存。

對照藥劑腐霉利購自四川潤爾科技有限公司，用于葡萄灰霉病發(fā)病期的防治。

1.2 拮抗菌株分離與培養(yǎng)

稱取供試土樣5 g，加入裝有45 mL無菌水的100 mL三角瓶中，置于搖床上振蕩30 min（200 r/min，28 ℃）充分混勻后80 ℃水浴15 min，無菌條件下吸取1 mL接入裝有9 mL無菌水的試管中，依次梯度稀釋至10-8，分別吸取10-6、10-7和10-8的懸浮液100 μL在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中涂布，并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

將新培養(yǎng)的平板單菌落分別接種到裝有50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h即得待測菌液。

1.3 拮抗菌株篩選

平板對峙法：將直徑為1.5 cm灰葡萄孢菌的菌餅，接至PDA培養(yǎng)基平板中心，在距菌餅2.5 cm處的左右兩邊各放置1個無菌牛津杯，分別向其中加入100 μL待測菌液，對照組加等量無菌菌液，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，每個處理3個重復。待對照菌落長滿平板時，測量抑菌帶寬度及病原菌菌落直徑。抑制率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.4 生物菌肥的制備

分別挑取培養(yǎng)24 h的目標生防芽胞桿菌菌株（BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1）接種至無菌的50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)好的發(fā)酵液加入12 g輕質(zhì)碳酸鈣攪拌均勻，置于干燥箱中37 ℃烘干至含水量為20%左右即得芽胞桿菌菌粉，將菌粉與有機水溶肥（微基生物技術(shù)（深圳）有限公司提供）按質(zhì)量比為 100:0.3的比例混合制得生物菌肥（BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1生物菌肥的微生物數(shù)量分別為3.5.0×1010、3.0×1010、6.5×1010和7.0×1010CFU/mL）。

1.5 拮抗菌株在離體葉片及果實上的抑制作用

將采摘的新鮮葡萄葉片或葡萄果實用無菌水沖洗，常溫無菌條件下風干，隨機分組，每組10片或10顆。用無菌手術(shù)刀在葉片主脈或葡萄果實兩側(cè)切出兩個長2 cm的傷口，然后將各組葉片或葡萄果實浸入灰葡萄孢菌菌懸液（106CFU/mL）中5 s后取出，自然晾干，再將葡萄葉片或葡萄果實分別浸于生物菌肥600倍稀釋液中15 s后取出晾干，以浸泡無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和無菌水作為對照組。將不同處理的葉片或果實在室溫條件（25 ℃）下置于培養(yǎng)皿（d=9 mm）的濾紙上，并滴加2 mL已滅菌的去離子水，7～15 d后觀察結(jié)果。葡萄灰霉病分級標準為：0級，全葉或者果無?。?級，25%以下葉或者果腐爛；2級，25～50%葉或者果腐爛；3級，50～75%葉或者果腐爛；4級，75%以上葉或者果腐爛，按照公式計算病情指數(shù)和生防效果。病情指數(shù)＝[Σ（各級病葉或者果數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值）/（調(diào)查葉或者果數(shù)×4）]×100，生防效果（%）＝[（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100。

1.6 生物菌肥對葡萄灰霉病田間防治效果

田間試驗在河北省衡水市饒陽縣屯里鄉(xiāng)屯里村、五公鎮(zhèn)許張保村和北廣村的葡萄塑料大棚（長1.5 m，寬11.5 m）進行，葡萄種植株距為1.2 m，行距為2.5 m，葡萄樹為成齡期第2年。試驗共設(shè)7個處理，每個處理3個重復，每個重復1壟（每壟10株葡萄樹）。將1.4方法制備的生物菌肥BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1分別各稀釋600倍、對照藥劑腐霉利（山東裕豐源農(nóng)業(yè)科技有限公司）稀釋600倍、空白對照（CK）及有機水溶肥對照。所有處理進行2次藥劑噴施，噴施時間選擇在上午9：00—11：00，7 d后相同方法進行第2次噴施，藥劑施用量均按照每棵葡萄2.5 g藥劑的用量進行（2.5 g/棵）。試驗前調(diào)查每行葉片總數(shù)，第二次施藥后分別于7、15 d調(diào)查葉片發(fā)病情況，病情指數(shù)和防治效果同上。

1.7 葡萄灰霉病拮抗菌株的鑒定

1.7.1 拮抗菌培養(yǎng)性狀觀察 將生防效果較好的4株菌株用劃線法分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)12 h后觀察菌落顏色及形態(tài)；經(jīng)革蘭氏染色后，在高倍顯微鏡（德國徠卡，DM2500）下觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。

1.7.2 拮抗菌的分子鑒定 將待鑒定菌株分別進行DNA的提取，選取適合的引物27F（5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′）進行 PCR 擴增，反應(yīng)體系為 25 μL：TaqMIX 12.5 μL，引物 27F和 1492R各 0.5 μL，DNA 1 μL，去離子水補足至 20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預變性10 min；93 ℃變性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸90 s。將PCR產(chǎn)物送至北京三博遠志技術(shù)有限公司所進行測序，待得到測序序列后，在NCBI進行BLAST比對，獲得同源序列，然后確定菌株分類地位[12]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析采用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 24，USA），進行數(shù)據(jù)的分析處理；系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA7（Mega Limited，Auckland，New Zealand）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標拮抗菌篩選

從不同地區(qū)土樣中分離獲得29株細菌菌株，通過平板對峙試驗篩選獲得14株具有拮抗性能，其中病原生長半徑小于1.50 cm以下（對照病原半徑4.23 cm）且抑制率大于60%的菌劑共用有7株，分別為BF 2-4、BF3-1、BF4-1、BF3-7、BF2-1、BF3-2及BF3-4（表1）。

表1 芽胞桿菌在平板上對灰葡萄孢抑制率Table 1 The inhibitory rate ofBacillusspp. againstB. cinereaon the plate

2.2 拮抗菌在離體葉片上的抑制作用

從圖1和表2可知，在14株供試拮抗菌株中，有7株具有明顯葉面防治效果。其中BF1-1、BF3-1、BF3-2、BF4-1、BF2-1對灰葡萄孢的抑制作用較好，抑制率可達50%以上。

圖1 拮抗菌株對灰葡萄孢菌離體葉片的抑菌活性Fig. 1 Aantagonistic effect of biocontrol strains againstB. cinereaon leaves

2.3 拮抗菌在離體果實上的抑制作用

從圖2和表3中可知，有7株菌具有明顯的病害防治效果，其中BF3-1、BF4-1、BF2-1和BF1-1可有效降低葡萄灰霉病的發(fā)生，抑制率達70%以上。

圖2 拮抗菌株對灰葡萄孢菌離體果實的抑菌活性Fig. 2 Antagonistic effect of biocontrol strains againstB. cinereaon fruit

表3 不同菌株對灰葡萄孢果實抑菌率Table 3 Bacterial inhibition rate of different strains on fruit ofB. cinerea

2.4 生物菌肥對葡萄灰霉病防治效果

由表4可知，BF3-1和BF4-1菌肥處理對葡萄灰霉病的田間防治效果分別達85.68%和82.07%，顯著高于水溶肥（54.35%）和腐霉利（67.30%）處理。

表4 不同處理對葡萄灰霉病的防治效果Table 4 Biocontrol effects of different treatments onB. cinerea

2.5 拮抗菌株的鑒定

2.5.1 形態(tài)學觀察 菌株BF1-1菌落呈白色，表面粗糙皺褶、邊緣不規(guī)則、直徑約為3 mm，產(chǎn)芽胞，芽胞排列呈桿狀、兩端呈圓形、單生，革蘭氏陽性，初步確定為芽胞桿菌屬。菌株BF2-1菌落呈淡黃色，表面粗糙不透明、邊緣不規(guī)則，產(chǎn)芽胞，芽胞兩端鈍圓、長短不一，革蘭氏陽性，初步確定為芽胞桿菌屬。菌株BF3-1菌落呈白色，表面粗糙不透明，常形成褶皺，伴有多處隆起。單個細胞（0.7～0.8）μm×（2～3）μm，著色均勻，鞭毛周生，能運動，無隔膜，革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽胞，芽胞（0.6～0.9）μm×（1.0～1.5）μm位于菌體中央或稍偏，芽胞形成后菌體不膨大，初步確定為芽胞桿菌屬。菌株BF4-1菌落似蠟燭樣顏色、近似圓形、質(zhì)地軟、無色素，菌落直徑5～7 mm，產(chǎn)芽胞，芽胞呈桿狀，芽胞中生或近中生，孢囊無明顯膨大，革蘭氏陽性，無莢膜，初步確定為芽胞桿菌屬。

2.5.2 分子鑒定 系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1分別與地衣芽胞桿菌Bacillus lincheniformis（MF871790.1）、解淀粉芽胞桿Bacillus amyloliquefaciens（MW433641.1）、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis（MW751907.1）和蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus（KC814716.1）處于同一分支，結(jié)合形態(tài)學觀察結(jié)果，菌株BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1分別鑒定為地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿、枯草芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌（圖3）。

圖3 生防菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig. 3 Phylogenetic dendrogram of the biocontrol strains

3 討論

本試驗從不同地區(qū)土樣中獲得29株細菌菌株，分離、培養(yǎng)并通過平板對峙試驗篩選獲得14株具有拮抗性能的菌株。將具有拮抗性能的細菌菌株進行離體葉片和離體果實抑制活性測定后發(fā)現(xiàn)，抑制率均在50%以上的拮抗菌有4株分別是BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1，經(jīng)菌株形態(tài)學特征以及分子生物學鑒定為地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌及蠟樣芽胞桿菌。此外，枯草芽胞桿菌BF3-1、蠟樣芽胞桿菌BF4-1在對峙培養(yǎng)試驗中均顯現(xiàn)出較強的抑制力。

有研究指出蠟樣芽胞桿菌生長繁殖能力強、分布范圍廣，可適應(yīng)較高溫度，烹飪時間短溫度不夠時不能將其完全殺死，可能會引起食物中毒等危害[13-15]，應(yīng)用安全性有待于進一步評估。此外，解淀粉芽胞桿菌BF2-1和地衣芽胞桿菌BF1-1雖不及枯草芽胞桿菌BF3-1和蠟樣芽胞桿菌BF4-1的抑制能力強，但仍表現(xiàn)出一定的拮抗效果。荊卓瓊[10]及陳哲等[16]、柴慶凱等[17]、黃靜等[18]、羅琳等[19]利用解淀粉芽胞桿菌分別防治番茄、黃瓜、草莓及葡萄等灰霉病，并取得較好的防治效果。也有研究表明地衣芽胞桿菌的菌劑可抑制黃瓜土傳病害的發(fā)生[20-22]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，單憑拮抗菌株是無法滿足生產(chǎn)過程中的綜合需求[23,24]，故本試驗嘗試將拮抗菌株與含有微量元素的有機水溶肥配合使用，發(fā)現(xiàn)無機營養(yǎng)元素成分的添加對于拮抗菌株的生防效果無明顯的抑制作用，表明拮抗菌株與其他成分配合使用是可行的，不僅能防治植物病害的發(fā)生，還可以葉面補充植物所需的營養(yǎng)，從而減少化肥使用，改善作物的品質(zhì)，增加作物的產(chǎn)量。但本試驗中僅采用了拮抗菌株菌粉和含有微量元素的有機水溶肥復合的一種比例，而產(chǎn)生防治效果不同可能與菌粉與水溶肥比例，以及水溶肥組成成分有關(guān)，因此相關(guān)工作還需進一步研究探討。