陽(yáng) 星，劉 橋，余達(dá)威，涂曉亮，田金環(huán)，李立華

1. 暨南大學(xué) 材料科學(xué)與工程系/人工器官及材料教育部工程研究中心，廣東 廣州 511486

2. 江南大學(xué) 食品學(xué)院/江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

海藻酸是一種由 α-L-古羅糖 醛酸 (G) 和 β-D-甘露糖醛酸 (M) 2種結(jié)構(gòu)單元通過(guò)1,4-糖苷鍵連接而成的褐藻多糖。藻酸鹽及其水凝膠具有良好的生物相容性，其中鈣、鈉、銨、鉀鹽被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為 GRAS (Generally recognized as safe，一般認(rèn)可為安全 )，因此被廣泛用于食品、抗菌及醫(yī)用生物材料[1-4]。

一氧化氮 (NO) 是在生物體內(nèi)履行各種重要功能的氣體分子[5-7]，具有維持內(nèi)皮的天然功能，并可作為內(nèi)源性血管擴(kuò)張劑和血小板黏附激活的天然抑制劑[7-8]。此外，NO還可調(diào)節(jié)血壓和血流量[9-11]、免疫反應(yīng)[12-13]、骨骼代謝和中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)[14]。NO 在高濃度 (超過(guò) 1 μmol·L-1) 環(huán)境下，將誘導(dǎo)亞硝化和氧化應(yīng)激，直接修飾膜蛋白，進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化，并破壞線粒體和細(xì)胞DNA[15]。這些過(guò)程可導(dǎo)致癌細(xì)胞和細(xì)菌壞死。因此，NO被認(rèn)為是抗癌[16-19]和抗菌治療[20-24]的潛在治療劑。海藻酸能夠吸收水體中的氨氮、硝氮、亞硝氮、磷酸鹽等無(wú)機(jī)鹽和尿素等有機(jī)物質(zhì)所含的氮(N)、磷(P)，并將其轉(zhuǎn)化為自身的生物質(zhì)成分。已有許多文獻(xiàn)報(bào)道將其固定化用于對(duì)海水養(yǎng)殖廢水的凈化[25-28]。人體內(nèi)存在大量S-亞硝基硫醇 (RSNO)，如S-亞硝基白蛋白(SNO-Alb)、S-亞硝基血紅蛋白 (SNO-Hb)、S-亞硝基半胱氨酸 (SNO-Cys) 及S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)，反硝化反應(yīng)將NO+官能團(tuán)從RSNO轉(zhuǎn)移到另一個(gè)現(xiàn)有的游離硫醇中，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)無(wú)限循環(huán)的NO供給。由于NO具有潛在的抗微生物和抗血栓形成功能，在過(guò)去的二十年中，釋放NO新型聚合物的開(kāi)發(fā)受到了關(guān)注。

本研究以我國(guó)盛產(chǎn)的褐藻多糖海藻酸為原料，利用半胱氨酸對(duì)其改性，引入活性巰基制備可原位成型的巰基化海藻酸鈉 (SA-SH)。并進(jìn)一步與NaNO2在pH 3.7下避光反應(yīng)，制備S-亞硝基海藻酸鈉 (SA-SNO)作為釋放NO供體。最后將巰基化海藻酸鈉 (SA-SH) 與S-亞硝基海藻酸鈉 (SA-SNO)復(fù)合制得了SA-SH/SA-SNO復(fù)合水凝膠，并測(cè)定了該水凝膠釋放、負(fù)載NO能力及抗菌性能，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)NO控釋抗菌提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉 (SA, Mn=120～190 kD, M/G=1.56) 購(gòu)于Sigma-Aldrich；L-半胱氨酸鹽酸鹽無(wú)水物 (LCysteine, 98%) 購(gòu)于阿拉丁生化科技有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl, ≥99%) 購(gòu)于上海笛柏生物科技有限公司；N-羥琥珀酰亞胺 (NHS, ＞99.5%) 購(gòu)于廣州碩恒生物有限公司；亞硝酸鈉 (NaNO2, 99%) 購(gòu)于上海邁瑞爾化學(xué)有限公司；5,5'-二硫雙 (2-硝基苯甲酸)(DTNB, AR) 購(gòu)于廣州市云天生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鈉(AR, 99%)、十二水合磷酸氫二鈉(AR)、β-甘油磷酸鈉水合物 (β-GP, 98%)、嗎啉乙磺酸 (MES, 99%) 均購(gòu)于麥克林生化科技有限公司；鹽酸 (HCl, AR)、氫氧化鈉 (NaOH, AR)、氯化鈉 (NaCl, AR)、無(wú)水乙醇 (AR) 均購(gòu)于廣州斯佳生物科技有限公司；Griess試劑購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SFG-02.400型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；ALPHA1-4/2-4/LS型冷凍干燥機(jī) (德國(guó)Christ公司)；HJ-6型磁力攪拌器 (金壇區(qū)西城新瑞儀器廠)；EL104型電子天平 (翰強(qiáng)儀器制造有限公司)；HH-W600B型數(shù)顯恒溫三用水箱 (常州朗越儀器制造有限公司)；Equinox 55型傅立葉紅外光譜儀 (德國(guó)Bruker公司)；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (日本島津)；K-Alpha+型X射線光電子能譜儀 (Thermo Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1 S-亞硝基海藻酸鈉抗菌水凝膠的合成

1) 巰基化海藻酸鈉 (SA-SH) 的合成。按照質(zhì)量濃度10 mg·mL-1在攪拌條件下緩慢溶解一定量SA粉末，并按濃度0.1 mol·L-1加入助溶劑嗎啉乙磺酸 (MES)[29]。攪拌至溶解完全，依次往反應(yīng)體系里加入一定量的EDC和NHS (EDC∶NHS∶COO-的摩爾比為1∶1∶1)。0.5 h后，按照摩爾比氨基比羧基為1∶1的量加入半胱氨酸鹽酸鹽無(wú)水物，半胱氨酸鹽酸鹽偏酸性，因此需要用氫氧化鈉溶液(1 mol·L-1) 來(lái)調(diào)節(jié)pH至5～6。避光攪拌反應(yīng)12 h后，將溶液裝入透析袋 (φ=80 mm, 8 000～14 000 kD)中，用去離子水透析3 d，每12 h換一次去離子水。透析結(jié)束后將透析袋內(nèi)溶液倒入培養(yǎng)皿中，于-20 ℃冰箱冷凍，然后放入凍干機(jī)凍干，即可得到SA-SH，最后于4 ℃條件下密封避光保存。

2) S-亞硝基海藻酸鈉 (SA-SNO) 的合成。將2 g·L-1SA-SH水溶液置于冰浴中避光冷卻至0 ℃左右，按巰基與亞硝基摩爾比為1∶2加入NaNO2攪拌。反應(yīng)1.5 h后，在冰浴中使用透析袋 (φ=80 mm,5 000～8 000 kD) 避光透析12 h以除去未反應(yīng)完的小分子。純化后，先將透析袋內(nèi)的SA-SNO溶液收集后放入-20 ℃冰箱凍結(jié)，再用凍干機(jī)冷凍干燥，得到SA-SNO并避光保存在0 ℃以下。

3) SA-SNO/SA-SH復(fù)合水凝膠的合成。稱取0.12、0.11、0.10、0.08、0.06 g的SA-SH，分別與0、0.01、0.02、0.04、0.06 g SA-SNO 復(fù)合 (為方便表達(dá)，以下用 β-GP-1、β-GP-2、β-GP-3、β-GP-4、β-GP-5來(lái)表示這5個(gè)組分比例的水凝膠)，加入3 mL去離子水，磁力攪拌下避光溶解，配成 4 g·L-1的水凝膠前驅(qū)液。滴加 58 g·L-1β-甘油磷酸鈉水合物 (β-GP) 將溶液調(diào)至中性，然后倒入24孔板中，置于37 ℃恒溫水浴箱中。8 h后取出，制得 β-GP-1、β-GP-2、β-GP-3、β-GP-4、β-GP-5 (圖 1)。

圖1 疏基化海藻酸鈉/S-亞硝基海藻酸鈉復(fù)合水凝膠形成的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of SA-SH/SA-SNO composite hydrogel formation

1.3.2 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)表征

分別稱取10 mg SA-SH和SA-SNO樣品于裝有10 mL PBS溶液的2支離心管中，振搖溶解后在37 ℃水浴箱中避光保溫15 min以獲得均勻的溶液。取出后立即用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄波長(zhǎng)與吸光度的關(guān)系圖。

1.3.3 傅立葉紅外光譜儀 (FTIR) 表征

取適量SA粉末，與KBr按照約1∶40的質(zhì)量比加入研缽內(nèi)研磨、混合均勻，取適量粉末用壓片機(jī)壓成透明的薄片，在FT-IR儀上進(jìn)行透射掃描(掃描波數(shù)=4 000～500 cm-1)。分別取適量的SASH和SA-SNO冷凍干燥樣品，直接進(jìn)行全反射掃描 (掃描波數(shù)=4 000～500 cm-1)。

1.3.4 樣品巰基含量測(cè)定

參照Ding等[30]方法，利用Ellman's試劑通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定SA-SH和SA-SNO中游離巰基的含量。巰基的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱量適量的半胱氨酸無(wú)水物樣品，并計(jì)算其巰基含量，再置于100 mL的容量瓶中，加水稀釋成濃度為10 μmol·mL-1的半胱氨酸溶液。再?gòu)脑撊芤褐芯_量取2.5 mL置于25 mL容量瓶中，加入22.5 mL水配成1 μmol·mL-1的半胱氨酸溶液。接著分別精確量取 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL 的 1 μmol·mL-1的半胱氨酸溶液置于10 mL容量瓶中，并加水將其配成濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 μmol·mL-1的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。精確移取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液2 mL于5 mL棕色離心管中，再各加入提前配置好的2 mL Ellman's試劑 [0.3 mg·mL-1DTNB溶液，溶質(zhì)為5,5'-二硫雙 (2-硝基苯甲酸)，溶劑為pH=8.0的PBS溶液]，室溫下避光反應(yīng)2 h。以不加半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)液作為空白組，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各個(gè)濃度半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液在450 nm處的吸光度。最后以濃度 (C, μmol·mL-1) 對(duì)吸光度(A) 進(jìn)行線性回歸，制定巰基的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的巰基含量測(cè)定：分別稱取冷凍干燥的SA-SH和SASNO樣品10 mg (每個(gè)樣品取3個(gè)平行樣為一組)于15 mL離心管中，并加入2.5 mL去離子水振搖溶解，再加入 2.5 mL PBS溶液 (0.5 mol·L-1、pH=8.0) 和5 mL Ellman's 試劑，然后在室溫下避光反應(yīng)2 h，同時(shí)，用同樣方法以不加樣品的離心管為空白對(duì)照，在450 nm條件下，測(cè)定各離心管溶液的吸光度。最后根據(jù)繪得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品游離巰基含量，最終結(jié)果以每1 g SA-SH和SASNO中巰基的量 (μmol)表示 (μmol·g-1)。

1.3.5 X 射線光電子能譜技術(shù) (XPS) 表征

隨機(jī)從SA-SH和SA-SNO樣品膜上剪取3塊5 mm×5 mm大小的樣品，用X射線光電子能譜儀(XPS) 獲得膜的XPS光譜。使用Avantage軟件 (VG Science) 進(jìn)行光譜分析。將飽和碳?xì)浠衔锏腘1s峰設(shè)置為402 eV進(jìn)行電荷校正，再將C1s、O1s和N1s峰的半峰值全寬分別固定在1.6、1.8和1.7 eV，并將高斯/洛倫茲比設(shè)置為50%對(duì)峰進(jìn)行擬合分析。

1.3.6 水凝膠中NO實(shí)時(shí)釋放速率與負(fù)載總量

水凝膠中NO釋放速率測(cè)定[31]：將水凝膠樣品 (200 μL) 浸入15 mL PBS的離心管中，密封后置于37 ℃的恒溫水浴箱中，在設(shè)定的時(shí)間間隔對(duì)離心管進(jìn)行采樣50 μL，并在空氣中暴露15 min，以產(chǎn)生亞硝酸鹽。首先利用標(biāo)準(zhǔn)液制定出格里斯試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線：從4 ℃冰箱取出NO試劑盒，待恢復(fù)至室溫后，按照說(shuō)明書將標(biāo)準(zhǔn)樣用PBS稀釋為不同濃度待用。在96孔板中每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品再向其中分別加入50 μL Griess I和II，避光反應(yīng)30 min，使用微孔板多功能檢測(cè)儀測(cè)定其在540 nm 處的吸光度。收集并處理數(shù)據(jù)，得到 NO釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線。從水凝膠溶液中吸取50 μL上清液到96孔板中，每孔依次加入50 μL Griess I和50 μL Griess II，避光反應(yīng)30 min，變色后用多功能酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)Griess試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水凝膠中NO的釋放量及釋放速率。

水凝膠中NO負(fù)載總量測(cè)定：將水凝膠樣品(200 μL) 浸入15 mL 37 ℃的PBS溶液中，再加熱至90 ℃ 保溫反應(yīng)2 h。冷卻至室溫后，用PBS將水凝膠溶液稀釋20倍，從稀釋后的溶液中吸取50 μL上清液添加到96孔板中，然后依次加入50 μL Griess I和50 μL Griess II，避光反應(yīng)30 min，變色后用多功能酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)Griess試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水凝膠中NO的負(fù)載總量。

1.3.7 水凝膠抑菌性測(cè)試

利用細(xì)菌在瓊脂板上擴(kuò)散的方法來(lái)初步評(píng)價(jià)水凝膠對(duì)大腸桿菌 (Escherichia coli ATCC25922) 和金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC25923)的抑制效果。將細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng)至菌液在600 nm處吸光度達(dá)0.5，此時(shí)菌落數(shù)約為108CFU·mL-1。然后將菌液稀釋100倍，取50 μL均勻涂布在瓊脂板表面，將水凝膠放在瓊脂板正中心。轉(zhuǎn)移到37 ℃5%的二氧化碳 (CO2) 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小。

為進(jìn)一步了解SA-SNO的殺菌過(guò)程，將β-GP-5水凝膠放入15 mL離心管中，每個(gè)離心管加入10 mL肉湯作為細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)液，以及50 μL細(xì)菌懸浮液和多個(gè)小玻片，用于掃描電鏡觀察。將細(xì)菌與水凝膠在37 ℃下培養(yǎng)2、6、12、24 h后將玻片取出，玻片表面用PBS洗滌2次以洗去肉湯等雜質(zhì)，將表面附著細(xì)菌的玻片在20 ℃下用甲醛固定、乙醇梯度脫水后，通過(guò)掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 巰基化海藻酸鈉的制備

海藻酸鈉的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元糖環(huán)上含有特征官能團(tuán)羥基和羧基。羧基可以在活化劑碳二亞胺偶聯(lián)劑(EDC/NHS) 的作用下被活化，活化后可與L-半胱氨酸中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵繼而形成巰基，具體合成路線見(jiàn)圖2。

圖2 疏基化海藻酸鈉合成線路圖Fig. 2 SA-SH synthetic circuit diagram

2.2 S-亞硝基海藻酸鈉的制備

SA-SH (圖3-b1) 與酸化的NaNO2在0 ℃下接觸會(huì)立即生成SA-SNO[32]，巰基和亞硝酸反應(yīng)生成S-亞硝基，反應(yīng)原理見(jiàn)圖3-a。溶液由無(wú)色變?yōu)闇\紅色 (圖3-b2)，至深紅色 (圖3-b3)。

圖3 S-亞硝基海藻酸鈉的合成路線圖 (a) 和巰基化海藻酸鈉與亞硝酸鈉反應(yīng)實(shí)圖 (b)Fig. 3 SA-SNO synthetic circuit diagram (a) and actual picture of reaction of thiolated sodium alginate and sodium nitrite (b)

2.3 紫外可見(jiàn)光譜分析

-SNO官能團(tuán)具有特征性的UV-Vis光譜[33]。SA-SNO的紫外光譜在340和540 nm左右會(huì)有明顯的特征峰，圖4中343 nm處的峰表明S-NO鍵的n0→p*電子躍遷，545 nm處的峰表示N-π*電子躍遷。沒(méi)有該官能團(tuán)的巰基化海藻酸鈉上則沒(méi)有這些峰。這2個(gè)峰能表明S-亞硝基海藻酸鈉主鏈上存在-SNO基團(tuán)，即反應(yīng)合成成功。

圖4 巰基化海藻酸鈉與S-亞硝基海藻酸鈉紫外掃描圖Fig. 4 UV-Vis diagrams of thiolated sodium alginate and S-nitrosated sodium alginate

2.4 FT-IR結(jié)果分析

對(duì)反應(yīng)物SA和2種產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜分析，從FI-IR圖5中可以看出，SA在1 595 cm-1出現(xiàn)的峰為海藻酸鈉中羧基官能團(tuán)的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在1 409 cm-1處的吸收峰為海藻酸鈉中羧基官能團(tuán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。當(dāng)海藻酸鈉經(jīng)過(guò)改性成為巰基化海藻酸鈉時(shí)，SA-SH則會(huì)在2 370 cm-1出現(xiàn)一個(gè)微弱的峰，這是巰基特有的特征。在1 698 cm-1處形成新峰，這是酯基的-C=O的伸縮振動(dòng)造成的。同時(shí)，在1 602 cm-1和1 409 cm-1處的峰分別是酰胺I帶的C=O伸縮振動(dòng)峰和酰胺II帶-NH面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，兩者最大的差別就是經(jīng)過(guò)巰基化改性，SA-SH在1 242 cm-1處形成了一個(gè)明顯的新峰，該峰是酰胺III帶-CN伸縮振動(dòng)峰。通過(guò)對(duì)兩者紅外圖譜的比較，SA-SH相比SA，無(wú)論是羧基的對(duì)稱和不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰還是羥基的伸縮峰，峰的強(qiáng)度都發(fā)生了明顯減弱，原因是SA進(jìn)行巰基化改性時(shí)加入了活化劑，海藻酸鈉的羧基被碳二亞胺偶聯(lián)劑活化，被活化的羧基與L-半胱氨酸鹽酸鹽的氨基結(jié)合形成酰胺鍵，小部分羧基與海藻酸鈉分子鏈上活化的羥基發(fā)生自交聯(lián)形成酯鍵。而SA-SNO的紅外譜圖相比另外2個(gè)，所有峰的強(qiáng)度均出現(xiàn)了明顯減弱，原因是巰基與亞硝酸鈉反應(yīng)，形成了亞硝基，圖中1 396 cm-1-SN的伸縮振動(dòng)峰很好地證明了這一點(diǎn)。

圖5 巰基化海藻酸鈉與S-亞硝基海藻酸鈉紅外譜圖Fig. 5 Infrared spectra of thiolated sodium alginate and S-nitrosated sodium alginate

2.5 巰基含量測(cè)定結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，通過(guò)數(shù)據(jù)處理得到L-半胱氨酸鹽酸鹽的游離巰基標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線公式為：A=3.737 1×C-0.028 6,R2=0.999 9 (450 nm, 0.025≤C≤0.3 μmol·mL-1)。為了提高巰基含量，選用較優(yōu)方法及配比，SA/L-cysteine (w/w) 配比為1∶1，海藻酸鈉選用中黏度分子量樣品。通過(guò)計(jì)算可得，所制備的SA-SH游離巰基質(zhì)量摩爾濃度為 (348.06±4.25) μmol·g-1。而 SA-SNO 是由 SA-SH中的游離巰基改性得到的，所以游離巰基質(zhì)量摩爾濃度大大降低，為 (158.96±0.56) μmol·g-1。

2.6 XPS結(jié)果分析

在SA-SH的XPS譜圖中觀察到了N1s峰 (402 eV)，N元素百分比含量為3.33%，這是SA與半胱氨酸反應(yīng)后形成的酰胺基的N元素量 (圖6)。SASH反應(yīng)生成SA-SNO后，分子上的半胱氨酸殘基上又引入了-SNO基團(tuán)，含氮量增加。在XPS圖上我們也可以看到更強(qiáng)的N1s峰，N元素百分比含量提高至8.91%。

圖6 巰基化海藻酸鈉與S-亞硝基海藻酸鈉XPS光譜圖Fig. 6 XPS spectra of thiolated sodium alginate and S-nitrosoalginate sodium

2.7 水凝膠中NO實(shí)時(shí)釋放速率與負(fù)載總量

NO的釋放量可通過(guò)Griess測(cè)定法[34]確定。不含SA-SNO成分的水凝膠也不產(chǎn)生NO，隨著SASNO在水凝膠中比例的增加，產(chǎn)物NO的量也隨之增多 (表1)。Hasan等[35]報(bào)道的 NO總釋放量為(0.23±0.006) μmol·mg-1，本實(shí)驗(yàn)中最好樣品 (水凝膠5號(hào)樣) 釋放的 NO 總量為其116%，NO負(fù)載量增加較多。

表1 水凝膠中一氧化氮的總負(fù)載量Table 1 Total loading of NO in hydrogel

在120 h內(nèi)，含不同-SNO量的水凝膠均迅速釋放NO，10 h后達(dá)到頂峰，之后逐漸衰減，4 d后趨于平緩，釋放速率為 10～20 μmol·(g·h)-1(圖 7)。其中高含量的SA-SNO水凝膠在120 h后依然有較高速率的 NO 釋放，為 30.12～44.32 μmol·(g·h)-1。因此，SA-SNO的初始濃度是決定水凝膠NO釋放速率的一個(gè)重要因素。SA-SH/SA-SNO水凝膠降解SNO生成NO的反應(yīng)性隨初始-SNO含量的增加而增大。這種現(xiàn)象與Maragos等[36]的研究結(jié)果一致，后者觀察到-SNO中NO的釋放速率與其初始濃度成正比。在熱激發(fā) (37 ℃) 或光的作用下，GelSNO分解生成噻吩基和NO [(反應(yīng) (1)]。新產(chǎn)生的噻吩基與GelSNO反應(yīng)形成二硫鍵和NO [反應(yīng) (2)]。同時(shí)，噻吩基與氧反應(yīng)生成過(guò)氧自由基[反應(yīng) (3)]。這些過(guò)氧自由基與GelSNO連續(xù)相互作用，生成NO和GSSG [反應(yīng) (4)]?？傮w而言，初始濃度較高的GelSNO會(huì)產(chǎn)生大量的硫代自由基，從而增加了NO的產(chǎn)生。

圖7 水凝膠120 h內(nèi)一氧化氮實(shí)時(shí)釋放曲線Fig. 7 Real-time release curve of NO from hydrogels in 120 h

2.8 水凝膠抑菌性分析

水凝膠能被用作傷口敷料，主要原因是其具有殺滅或抑制細(xì)菌的能力，從而避免外界細(xì)菌感染并促進(jìn)傷口愈合[3]。利用抑菌圈實(shí)驗(yàn)研究了水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果 (圖8)。隨著S-亞硝基濃度的增加，抑菌圈直徑逐漸增大，表明抑菌效果不斷增強(qiáng)。此外，掃描電鏡圖可進(jìn)一步觀察到水凝膠的殺菌過(guò)程。首先，與水凝膠共培養(yǎng)1 h后，大腸桿菌呈棒狀 (圖9-a)，金黃色葡萄球菌呈圓形 (圖9-e)，均顯示出光滑的細(xì)胞膜。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水凝膠開(kāi)始持續(xù)釋放NO，細(xì)菌受到抑制，其形態(tài)發(fā)生了變化。在培養(yǎng)6 h后的細(xì)菌掃描圖中，大腸桿菌開(kāi)始收縮 (圖9-b)，金黃色葡萄球菌個(gè)體變小，表面出現(xiàn)破損 (圖9-f)。培養(yǎng)12 h后的細(xì)菌掃描圖 (圖9-c、圖9-g) 顯示，兩種細(xì)菌的細(xì)胞膜發(fā)生破裂、變形，細(xì)菌開(kāi)始干癟、爆裂分解。培養(yǎng)24 h后 (圖9-d、圖9-h)，只有細(xì)菌破裂的殘骸。這些變化表明，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的膜被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，最后細(xì)菌被滅殺破裂。相對(duì)而言，水凝膠對(duì)陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌顯示出了更好的抑菌效果，這可能與NO抗菌作用機(jī)理相關(guān)。有研究表明NO破壞了細(xì)菌生物膜，導(dǎo)致大量基質(zhì)外泄，造成細(xì)菌死亡[37]，也有研究認(rèn)為NO能通過(guò)抑制細(xì)胞呼吸、減少細(xì)胞外膜蛋白的合成或抑制細(xì)胞壁的形成等機(jī)制殺菌[38]，目前尚未有定論。

圖8 水凝膠的抑菌圈測(cè)試Fig. 8 Inhibition zone test of hydrogels

圖9 與水凝膠共培養(yǎng)1、6、12、24 h的細(xì)菌形貌Fig. 9 Morphology of bacteria co-cultured with hydrogel for 1, 6, 12, 24 h

3 結(jié)論

本研究以生物相容性良好的海藻多糖原料——海藻酸鈉為基體，制備了可原位成型的巰基化海藻酸水凝膠以利于無(wú)規(guī)則創(chuàng)面的使用，設(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)便高效的方法合成NO供體——SA-SNO。通過(guò)將2種改性膠復(fù)合成功地開(kāi)發(fā)出可釋放NO的SA-SH/SASNO抗菌水凝膠。水凝膠NO釋放實(shí)驗(yàn)顯示水凝膠供體在生理?xiàng)l件下具有優(yōu)良的NO釋放性能，控制反應(yīng)條件和反應(yīng)物SA-SNO的量，可以在10×nmol到μmol范圍內(nèi)調(diào)節(jié)水凝膠NO的釋放，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌均表現(xiàn)出顯著的殺菌效果。本研究還存在一些問(wèn)題，如未確定材料的具體殺菌機(jī)制，作為抗菌促修復(fù)傷口敷料，其生物相容性還需進(jìn)一步探討。但總的來(lái)說(shuō)，由于該水凝膠可持續(xù)釋放較高含量的NO且具有顯著的殺菌效果，有望作為抗菌敷料，在傷口感染治療和組織修復(fù)方面具有較好的應(yīng)用前景。