王 芳，董 菁，李艷妮，徐秦峰

（陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

核酸分子的快速檢測對疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測以及食品安全等領(lǐng)域具有十分重要的意義。傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）［1］具有靈敏、準確度高等優(yōu)勢，但是需要復(fù)雜的操作和精密的溫控儀器［2］。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)可以在恒溫條件下實現(xiàn)特異、高效的核酸擴增，其靈敏度和擴增產(chǎn)物量比傳統(tǒng)PCR高出一個數(shù)量級，適合于現(xiàn)場和檢測條件較簡單的實驗室進行快速核酸檢測［3－5］。

目前LAMP擴增產(chǎn)物的檢測方法主要有凝膠電泳法、濁度法和熒光染料法［6－7］。凝膠電泳法用時較長不適合現(xiàn)場分析，并且需要開管操作，極易造成氣溶膠污染；濁度法檢測避免了開蓋操作但僅在短時間內(nèi)穩(wěn)定，且存在主觀誤差和檢出限高的缺點。LAMP可視化熒光染料如鈣黃綠素和SYBR Green I均對擴增反應(yīng)有一定抑制，且存在Stoke's位移?。?0 nm）等問題，影響其對于核酸檢測的實際應(yīng)用。與有機染料相比，無機配合物核酸分子光開關(guān)［Ru（bpy）2（dppz）］2+具有Stoke's位移大（150 nm）、性質(zhì)穩(wěn)定、易于合成等優(yōu)點［8－11］，適合用作可視化核酸檢測染料。最近有研究將［Ru（phen）2dppz］2+用于檢測紙基芯片上的LAMP擴增反應(yīng)產(chǎn)物［12］，但開管檢測容易造成擴增產(chǎn)物氣溶膠的污染［13－15］。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的［Ru（bpy）2（dppz）］2+對LAMP擴增的抑制作用較小，因此可以在擴增反應(yīng)前加入，用于LAMP的實時熒光定量檢測［8］。雖然實時檢測可以實現(xiàn)全程閉管，但需要大型儀器，無法普及使用。為能閉管引入高濃度染料而不影響LAMP擴增反應(yīng)，本實驗通過采用微晶蠟［16－18］將擴增體系與［Ru（bpy）2（dppz）］2+檢測試劑在一個反應(yīng)管中分隔開，使擴增與檢測染料在LAMP反應(yīng)時互不接觸，待反應(yīng)結(jié)束時熔化微晶蠟使兩者混合即可在藍光激發(fā)下產(chǎn)生明顯的紅色熒光信號（圖1）。該方法既克服了可視化檢測所需的高濃度染料直接添加至反應(yīng)溶液中對LAMP造成的強烈抑制，也避免了由于開蓋引起的氣溶膠交叉污染問題，實現(xiàn)了一種常見食源性致病菌（金黃色葡萄球菌，S.aur eus）DNA模型分析物的閉管、快速、可視化熒光檢測。

圖1 閉管可視化LAMP檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram of visualized closed-tube LAMP detection

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高速冷凍離心機、移液槍（Eppendorf AG公司）；移液槍槍頭（Axygen Scientific公司）；電熱恒溫水槽（上海精宏試驗設(shè)備有限公司）；分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；瓊脂糖水平電泳儀（Bio－Rad Laboratories公司）；電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）；B－BOX藍光透射儀（Smobio Technology公司）；超微量分光光度計（Thermo Scientific公司）；生物潔凈型標準潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；微孔板（Corning公司）；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（Thermo Scientific公司）；紫外－可見－近紅外分光光度計（美國安捷倫公司）。

Deoxynucleotide（dNTP）Solution Mix、Bst 2.0 WarmStar?DNA Polymerase、MgSO4Solution（New England Biolabs）；細菌基因組DNA提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；瓊脂糖（Thermo Fisher Scientific）；NaCl（Sigma公司）；微晶蠟（滄州東方蜂蠟?zāi)z業(yè)有限公司）；［Ru（bpy）2（dppz）］2+（Jena Bioscience公司）。

金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌的4條引物，以及沙門氏菌的4條引物均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列如表1所示。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Sequence of primers used in the experiment

1.2 食源性致病菌DNA提取

本實驗采用磁珠法［19］提取增菌培養(yǎng)液中的DNA。食源性致病菌分別為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、沙門氏菌（S.spp）、單核細胞增生李斯特菌（L.mon）、溶藻弧菌（V.al g）。使用超微量核酸定量儀測定DNA濃度和純度后分裝放置于－20℃保存，備用。

1.3 閉管可視化LAMP檢測

1.3.1 閉管LAMP擴增與可視化檢測本實驗采用10μL LAMP反應(yīng)體系，包括等溫擴增緩沖液（1.00μL，200 mmol/L Tris－HCl，100 mmol/L（NH4）2SO4，500 mmol/L KCl，20 mmol/L MgSO4，1%Tween－20，pH 8.8，25℃），dNTP（1.40μL，10 mmol/L），甜菜堿（1.60μL，5 mol/L），MgSO4（0.45μL，100 mmol/L），酶（0.40μL，8 000 U/mL），S.aur－F3（0.50μL，4 mol/L），S.aur－B3（0.50μL，4 mol/L），S.aur－FIP（0.32μL，50 mol/L），S.aur－BIP（0.32μL，50 mol/L）。按上述劑量配制反應(yīng)基液，裝入PCR管中，加入1μLS.aureusDNA；同時設(shè)置無模板陰性對照并用雙蒸水補齊10μL體系。

在200μL PCR管中加入［Ru（bpy）2（dppz）］2+溶液，取適量微晶蠟（熔點78℃左右）加熱至80℃使蠟融化，將檢測溶劑密封于管底。待微晶蠟?zāi)毯螅谙炆戏郊尤霐U增體系并設(shè)置有模板與空白對照進行擴增，水浴鍋60℃溫育60 min。在LAMP擴增時微晶蠟呈固態(tài)，染料與擴增體系分離，互不干擾。待擴增結(jié)束后升高溫度至80℃使微晶蠟融化并使核酸擴增酶失活，搖晃離心管使染料與擴增產(chǎn)物接觸，在藍光透射儀下觀察顏色。

1.3.2 凝膠電泳及熒光光譜表征采用2%的瓊脂糖凝膠電泳法對S.aur eus的LAMP擴增產(chǎn)物進行分析鑒定。另取待檢測樣品100μL于微孔板中，使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀測定熒光光譜，激發(fā)波長450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫12 nm。

1.3.3 LAMP擴增與檢測條件優(yōu)化對熒光染料［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度（5、10、15、20、25μmol/L）、擴增溫度（50、55、60、65、70℃）、擴增時間（20、40、60、80、100 min）以及鎂離子濃度（0、2、4、6、8、10 mmol/L）等實驗條件進行了優(yōu)化。10μL LAMP反應(yīng)體系中，擴增體系配置同“1.3.1”，在水浴鍋中進行擴增后于藍光透射儀下觀察顏色，并通過智能手機進行拍照。

1.3.4 可視化閉管LAMP方法的靈敏度與特異性將S.aur eus模板DNA以10倍比例梯度稀釋，濃度依次為：2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2拷貝/反應(yīng)。每個梯度取1μL為模板，按優(yōu)化的實驗條件進行反應(yīng)，驗證方法靈敏度。

以S.s pp、L.mon、V.alg的基因組DNA分別作為待測樣品模板，S.aureus的基因組DNA作為模板陽性對照，雙蒸水作為模板陰性對照（NTC）。按照優(yōu)化的實驗條件進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過觀察顏色變化驗證方法特異性。

1.3.5 可視化閉管LAMP方法的通用性及模擬樣品檢測將目標引物更換為S.s pp、L.mon的引物，以S.s pp、L.mon的基因組DNA分別作為待測樣品模板，其它菌種基因組DNA和沒有模板的樣品作為對照。按照優(yōu)化的實驗條件進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過觀察顏色變化驗證方法通用性。

以S.aureus人工污染超高溫瞬時滅菌（UHT）常溫奶作為模擬樣品，磁珠法提取DNA作為擴增模板。按照優(yōu)化的實驗條件進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過觀察顏色變化驗證方法實用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于核酸分子“光開關(guān)”的LAMP目視檢測可行性驗證

由實驗室前期研究成果可知［8］：［Ru（bpy）2（dppz）］2+在LAMP擴增體系中的最大耐受濃度為2μmol/L，超過該濃度會抑制LAMP擴增反應(yīng)；但［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度較高時（＞10μmol/L）方能得到較好的可視化比色效果。LAMP擴增過程與可視化比色過程對［Ru（bpy）2（dppz）］2+的濃度要求差異較大，無法同時滿足。因此不能將［Ru（bpy）2（dppz）］2+在擴增前直接加入至擴增體系中。而在擴增后開管加入［Ru（bpy）2（dppz）］2+進行比色，容易引起氣溶膠污染造成“假陽性”，影響后續(xù)實驗。因此本實驗采用微晶蠟構(gòu)建LAMP擴增與檢測的閉管模式。該方法原理如圖1所示，利用微晶蠟將位于反應(yīng)管底部的［Ru（bpy）2（dppz）］2+檢測溶液體系與LAMP擴增溶液體系分隔開來。由于LAMP擴增反應(yīng)溫度（60℃）低于微晶蠟熔點溫度（78℃），因此在整個LAMP擴增反應(yīng)過程中微晶蠟呈固態(tài)，擴增體系與染料分別處于微晶蠟的上下層，高濃度的染料不會對擴增反應(yīng)造成干擾。待擴增結(jié)束后升溫至80℃使微晶蠟融化，染料與擴增產(chǎn)物DNA相互混合，即可在閉管狀態(tài)通過藍光透射儀檢測擴增反應(yīng)是否發(fā)生。陽性發(fā)射紅色熒光，陰性則無熒光發(fā)射。該方法解決了染料抑制擴增和開管氣溶膠污染風(fēng)險的問題，實現(xiàn)了LAMP擴增反應(yīng)的閉管可視化檢測。

如圖2A所示，直接添加［Ru（bpy）2（dppz）］2+試劑未用蠟分隔時，陽性與陰性無明顯區(qū)分；而用蠟將染料與擴增體系分隔開時，產(chǎn)生明顯的顏色變化，紅色陽性樣品與無色陰性樣品顏色對比明顯。對兩組樣品進行熒光光譜掃描，結(jié)果與目視比色結(jié)果一致（圖2B）：用蠟分隔的陽性與陰性樣品在［Ru（bpy）2（dppz）］2+最大發(fā)射波長處的熒光強度具有很大差異；而未用蠟隔開的樣品，陽性與陰性樣品的熒光強度均很弱且無明顯區(qū)分。凝膠電泳表征結(jié)果（圖2C）顯示，直接加［Ru（bpy）2（dppz）］2+未用蠟分隔開時，高濃度的染料抑制了LAMP擴增反應(yīng)，在凝膠電泳圖中無LAMP擴增產(chǎn)物特征條帶出現(xiàn)；當(dāng)用蠟將染料與擴增體系分隔開時，在凝膠電泳圖中有LAMP擴增產(chǎn)物特征條帶出現(xiàn)，LAMP擴增反應(yīng)正常，與可視化比色結(jié)果、熒光光譜圖一致。綜上所述，采用微晶蠟分隔擴增體系與檢測染料可以實現(xiàn)可視化LAMP檢測，且全程閉管避免污染。

圖2 LAMP檢測的目視比色圖（A）、熒光光譜圖（B）與瓊脂糖凝膠電泳圖（C）Fig.2 Visual image（A），fluorescence spectrogram（B）and agarose gel electropherogram（C）of LAMP detection

2.2 實驗條件優(yōu)化

為了達到最佳的可視化檢測效果，分別對擴增條件和檢測條件進行了優(yōu)化。［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3A所示。只有當(dāng)染料濃度大于10μmol/L時方可達到較明顯的紅色陽性、無色陰性的顏色對比。綜合考慮檢測效果的穩(wěn)定性和實驗成本，后續(xù)實驗選擇15μmol/L作為［Ru（bpy）2（dppz）］2+染料濃度。Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3B所示，鎂離子濃度為8 mmol/L時，顯色反應(yīng)最為明顯，當(dāng)鎂離子濃度小于8 mmol/L時，擴增效果不好，不能達到較好的顯色。因此確定擴增最佳鎂離子濃度為8 mmol/L。

對LAMP擴增反應(yīng)時間和溫度進行了優(yōu)化。結(jié)果如圖3C、D所示：反應(yīng)時間大于60 min，陽性樣品均有明顯的顏色變化；反應(yīng)溫度為60℃時，陽性陰性顏色對比最為明顯。綜合考慮時間和最佳檢測效果，選擇60℃溫度下反應(yīng)60 min進行后續(xù)實驗。

圖3 ［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度（A）、Mg2+濃度（B）、反應(yīng)時間（C）及反應(yīng)溫度（D）的優(yōu)化Fig.3 Optimization of［Ru（bpy）2（dppz）］2+concentration（A），Mg2+concentration（B），reaction time（C）and reaction temperature（D）

2.3 閉管可視化LAMP檢測的靈敏度及特異性

為確定方法能夠檢測到的最低模板DNA的含量，以10倍比例梯度稀釋S.aur eus模板DNA進行熒光目視比色實驗。結(jié)果如圖4A所示：可視化檢測可達到20拷貝/反應(yīng)的檢出限，且可視化檢測結(jié)果與凝膠電泳驗證結(jié)果（圖4B）相一致。表明基于［Ru（bpy）2（dppz）］2+的可視化檢測方法具有較高的檢測靈敏度。

方法的特異性檢測結(jié)果如圖4C所示：只有加入目標菌種S.aur eus模板DNA時有明顯的紅色，無模板或者加入其它非目標致病菌模板時均無明顯顏色變化。凝膠電泳結(jié)果（圖4D）顯示，只有S.aureus樣品有LAMP擴增產(chǎn)物特征梯狀條帶產(chǎn)生；其它非目標菌樣品以及陰性對照無擴增條帶產(chǎn)生?？梢暬瘷z測結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果一致，表明所建立的方法特異性強。

圖4 LAMP熒光目視比色法的靈敏度目視圖（A）和凝膠電泳圖（B），以及特異性目視圖（C）和凝膠電泳圖（D）Fig.4 Fluorescent（A），gel electrophoresis（B）images for sensitivity detection，and fluorescent（C），gel electrophoresis（D）images for specificity detection of visualized closed-tube LAMP detection

2.4 閉管可視化LAMP的通用性及模擬樣品檢測

為驗證該方法的通用性，分別采用L.mon和S.sp p特異性引物進行熒光目視比色實驗。結(jié)果如圖5A所示：只有加入目標菌種模板DNA時有明顯的紅色，無模板或加入其它非目標致病菌模板時均無明顯顏色變化，表明該方法具有較好的通用性。

為驗證所建立方法的實用性，對人工S.aur eus污染的UHT常溫牛奶樣品進行熒光目視比色檢測。在無菌環(huán)境及操作下，設(shè)置S.aureus陽性實驗組、UHT常溫奶中加入S.aureus實驗組、UHT常溫奶實驗組模擬樣品進行檢測，同時設(shè)置相應(yīng)的無模板陰性對照。結(jié)果如圖5B所示，向UHT常溫奶中加入S.aureus實驗組有明顯的紅色，與S.aur eus陽性實驗組現(xiàn)象相一致，但UHT常溫奶實驗組并無明顯顏色變化（圖5B上排）；并且3組無模板陰性對照均無明顯的顏色變化（圖5B下排）。因此，該方法在樣品檢測中具有一定的實用性且檢測結(jié)果可靠。

圖5 LAMP熒光目視比色法通用性目視圖（A）和模擬樣品檢測熒光光譜圖（B）Fig.5 Fluorescent images for universality detection of visualized closed-tube LAMP detection（A）and fluorescent images for milk sample detection（B）

3 結(jié) 論

本文將LAMP恒溫擴增與［Ru（bpy）2（dppz）］2+相結(jié)合，建立了基于［Ru（bpy）2（dppz）］2+的閉管可視化LAMP檢測方法。該方法采用微晶蠟分隔構(gòu)建閉管檢測模式，避免了LAMP大量產(chǎn)物可能造成的氣溶膠污染風(fēng)險問題。通過優(yōu)化［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度等實驗條件，實現(xiàn)了高特異性和高靈敏度的可視化檢測。該檢測能夠在1 h內(nèi)完成，檢出限低至20拷貝/反應(yīng)。該方法具有可視化檢測對比效果明顯、特異性好、靈敏度高、通用性強以及簡單快速等優(yōu)勢，可應(yīng)用于環(huán)境檢測、食品安全、臨床診斷等領(lǐng)域的現(xiàn)場快速核酸檢測。