徐人杰 張濤 潘海滔 欽博 周萍

[摘要] 目的 研究坤復(fù)康片中的異澤蘭黃素小腸吸收和坤復(fù)康片對(duì)其吸收的影響。方法? Caco-2細(xì)胞模型研究不同藥物濃度、pH值、溫度和抑制劑對(duì)異澤蘭黃素雙向滲透吸收的影響。采用藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究坤復(fù)康片在體內(nèi)對(duì)異澤蘭黃素吸收的影響。結(jié)果 數(shù)據(jù)表明，異澤蘭黃素在Caco-2細(xì)胞模型中吸收較差，三種待測(cè)濃度下其吸收僅為3.27×10-7cm/s至5.37×10-7cm/s[從頂膜端（AP）到底膜端（BL）]和從6.27×10-7cm/s至9.63×10-7cm/s（從BL到AP），其轉(zhuǎn)運(yùn)具有pH和溫度依賴性。異澤蘭黃素的細(xì)胞通透性受多耐藥蛋白抑制劑MK571和吲哚美辛的影響。當(dāng)坤復(fù)康溶液加入后，異澤蘭黃素的吸收顯著性增加，從4.41×10-7cm/s至6.43×10-7cm/s（從AP到BL）。在藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，坤復(fù)康組的異澤蘭黃素相對(duì)于單體組有更大的吸收入血暴露量。 結(jié)論? 坤復(fù)康片中某些成分會(huì)顯著促進(jìn)異澤蘭黃素的吸收。

[關(guān)鍵詞] 異澤蘭黃素;Caco-2;口服;吸收機(jī)制;坤復(fù)康片

[中圖分類號(hào)] R969.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）06-0038-05

[Abstract] Objective To study the small intestinal absorption of eupatilin in Kunfukang tablets and the effect of Kunfukang tablets on its absorption. Methods Caco-2 cell model was used to study the effects of different drug concentrations， pH values， temperatures， and inhibitors on the bidirectional permeation and absorption of eupatilin.? Pharmacokinetic experiments were used to study the effect of Kunfukang tablets on the absorption of eupatilin in vivo. Results Data showed that eupatilin was poorly absorbed in the Caco-2 cell model， and its absorption was 3.27×10-7cm/s to 5.37× 10-7cm/s （from AP to the BL） and from 6.27×10-7cm/s to 9.63×10-7cm/s（from BL to AP） at three concentrations to be measured. Its transport was pH and temperature-dependent. The cell permeability of eupatilin was affected by the multidrug resistance protein inhibitors MK571 and indomethacin. After the addition of Kunfukang solution， the absorption of eupatilin significantly increased， from 4.41×10-7cm/s to 6.43×10-7cm/s （from AP to BL）. In the pharmacokinetic experiment， the absorption exposure of eupatilin in the Kunfukang group was greater than that in the monomer group. Conclusion Some components in Kunfukang tablets can significantly promote the absorption of eupatilin.

[Key words] Eupatilin; Caco-2; Oral; Absorption mechanism; Kunfukang tablets

坤復(fù)康片是著名的中藥配方，包括赤芍、苦參、香附、豬苓、女貞子、南劉寄奴、烏藥、粉萆解、扁蓄等幾種中藥材，臨床用于治療中國(guó)女性的骨盆炎癥[1-3]。異澤蘭黃素是坤復(fù)康片中最重要的黃酮類化合物之一，來(lái)源于南劉寄奴[4]。各種藥理研究表明，異澤蘭黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗過(guò)敏等作用[5-8]。研究表明異澤蘭黃素的絕對(duì)生物利用度偏低[9-10]。小腸吸收障礙是影響外源性物質(zhì)生物利用度的重要因素[11-12]。探討異澤蘭黃素的腸道吸收機(jī)制不僅是研究其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)所必需的，還為其起效機(jī)制提供了關(guān)鍵信息。本研究旨在通過(guò)體外Caco-2實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示異澤蘭黃素的小腸吸收機(jī)制，并探討坤復(fù)康片對(duì)異澤蘭黃素口服吸收的影響[13-16]，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

1.1.1? 試劑? Transwell 轉(zhuǎn)運(yùn)小室（12孔，0.4 μmol/L）;96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（Corning 公司，美國(guó)）。緩沖鹽溶液（hanks balanced salt solutions，HBSS），二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），DMEM培養(yǎng)基由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。坤復(fù)康片（陜西康惠制藥股份有限公司，批號(hào) 200901）均為市售品。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazo liumromide，MTT）購(gòu)自白鯊生物科技有限公司;細(xì)胞Caco-2 細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，代數(shù)在35～50代。

1.1.2? 儀器? Applied Biosystem 5500 QTRAP?hybrid triple-quad 三重四極桿質(zhì)譜（美國(guó)AB科學(xué)技術(shù)公司）;ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（美國(guó)安捷倫科技有限公司，50 mm×2.1 mm，1.8 μmol/L）?？缒る娮鑳x（Millicell ERS system，Millipore，MA，美國(guó)）。

1.2? 方法

1.2.1? 色譜及質(zhì)譜條件? 流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B）。梯度洗脫如下：0～5.0 min，1.0→95.0% A;5.0～7.0 min 95.0% A;7.0～7.1 min，95.0→1.0% A;7.1～9 min， 1.0% A。在線脫氣;流速：0.4 ml/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：2 μl。

ESI離子源，負(fù)離子模式;采集方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。m/z 343.0 → 328.0（異澤蘭黃素），m/z 415.1 → 267.1（葛根素，內(nèi)標(biāo)），碰撞能量（CE）：-26 V（異澤蘭黃素），-40 V（葛根素）。

1.2.2? 坤復(fù)康溶液的配制? 坤復(fù)康片研磨后用水充分溶解后超聲離心沉淀，收集水溶液1 ml置于10 ml容量瓶中定容。異澤蘭黃素在坤復(fù)康片中的含量約為2.012 mg/g，在坤復(fù)康水溶液中約為5.850 μmol/L。

1.2.3? 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制? 精密稱取異澤蘭黃素對(duì)照品適量，用DMSO 配制成濃溶液，實(shí)驗(yàn)前用HBSS（用于Caco-2實(shí)驗(yàn)）或甲醇（用于藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)）稀釋至所需藥物濃度。

1.2.4? 樣本處理? 培養(yǎng)基或大鼠血漿樣品50 μl，加入70 ng/ml葛根素甲醇溶液10 μl，補(bǔ)足390 μl甲醇，渦旋離心后吸取2 μl上清進(jìn)樣LC-MS/MS分析。

1.2.5? Caco-2細(xì)胞毒? 采用MTT法檢測(cè)異澤蘭黃素的細(xì)胞毒性。

細(xì)胞存活率（%）=A 實(shí)驗(yàn)組/A 對(duì)照組×100%。

1.2.6? 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)? 研究異澤蘭黃素在5、20、80 μmol/L下的轉(zhuǎn)運(yùn)行為。4℃和37℃下研究溫度對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。研究pH 6.0或pH 7.4對(duì)異澤蘭黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

將若干種抑制劑分別預(yù)處理轉(zhuǎn)運(yùn)體系研究幾種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響，包括P-糖蛋白（p-glycoprotein， p-gp）抑制劑維拉帕米;多耐藥蛋白（multidrug resistance-related proteins，MRPs）抑制劑MK571、苯溴馬隆（multidrug resistance-related protein 3，MRP3）和吲哚美辛（multidrug resistance-related protein 2，MRP2）;乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）抑制劑芹菜素。通過(guò)添加釩酸鈉和西咪替丁評(píng)估Na/K-ATPase的選擇性;加入左旋肉堿或奎尼丁評(píng)估有機(jī)陽(yáng)離子/麥角硫因轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（recombinant organic cation/erg-othioneine transporter，OCTN1）或OCTN2蛋白是否參與到異澤蘭黃素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中。

1.2.7? 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)? 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心指南和規(guī)章制度操作，并通過(guò)上海交通大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核。Sprague-Dawley（SD）大鼠（210～230 g）由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（滬）2017-0004。分別灌胃口服異澤蘭黃素混懸液20 mg/kg或坤復(fù)康溶液10.58 g/kg（含約20 mg/kg異澤蘭黃素）。

1.3? 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

Caco-2實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表觀滲透系數(shù)（apparent permeability，Papp）值和外排率（efflux ratio，ER） 值表示。

PappP=（dQ/dt）/（A·C0）;ER=PappBA/ PappAB

式中：A 為Transwell 小室的有效面積;dQ/dt為轉(zhuǎn)運(yùn)速率;C0為藥物的初始濃度;PappBA為BL 到AP側(cè)的Papp值;PappAB 為AP 到BL 側(cè)的Papp值。當(dāng)ER > 1.5提示可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，ER≤1.5提示以被動(dòng)擴(kuò)散為主[17]。

藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)由給藥后的藥-時(shí)曲線及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)表示。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò) Analyst 1.5.2和MultiQuant 3.0.0軟件處理，藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)通過(guò)DAS 2.0軟件分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間差異用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 異澤蘭黃素的含量測(cè)定

代表性質(zhì)譜圖如圖1所示，該測(cè)定方法下異澤蘭黃素在培養(yǎng)基和血漿中的線性范圍分別為2.5 ng/ml至500 ng/ml和5 ng/ml至500 ng/ml。

2.2? 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，異澤蘭黃素濃度小于200 μmol/L或濃度為0.58 mg/ml坤復(fù)康溶液對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率小于10%。

2.3? 濃度和時(shí)間對(duì)異澤蘭黃素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

異澤蘭黃素三種濃度下的PappAB從3.27×10-7cm/s至5.37×10-7cm/s（從AP到BL）和從6.27×10-7cm/s至9.63×10-7cm/s（從BL到AP）。見(jiàn)圖2。

異澤蘭黃素在檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)隨時(shí)間呈線性增長(zhǎng)，表明異澤蘭黃素的轉(zhuǎn)運(yùn)有時(shí)間依賴性。

2.4? pH和溫度對(duì)Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)異澤蘭黃素的影響

異澤蘭黃素在pH 7.4時(shí)的PappAB值明顯高于在pH 6.0時(shí)的PappAB值（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

溫度降低會(huì)降低細(xì)胞的新陳代謝，降低異澤蘭黃素轉(zhuǎn)運(yùn)效率[18]。低溫（4℃）孵育使PappAB從4.90×10-7cm/s降低到1.91×10-7cm/s。見(jiàn)圖3。

2.5? 異澤蘭黃素在Caco-2細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果

在MK 571預(yù)處理的情況下，異澤蘭黃素的PappAB幾乎是對(duì)照組的2.7倍，而其PappBA值則降低38.26%。文獻(xiàn)報(bào)道表明， MRP2和MRP3分別存在Caco-2細(xì)胞的頂膜端和基底端[19-20]。吲哚美辛是一種MRP2抑制劑，顯著提高了異澤蘭黃素的PappAB值（P<0.05）。見(jiàn)表1。此外，當(dāng)加入坤復(fù)康片處理液后，異澤蘭黃素的PappAB顯著性升高。

2.6? 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

坤復(fù)康組中異澤蘭黃素的Cmax值為單體組的127.60%，兩組達(dá)峰時(shí)間（Tmax）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組中異澤蘭黃素的血漿暴露量（AUC0-t和AUC0-∞）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但MRT和t1/2值無(wú)顯著差異，說(shuō)明坤復(fù)康片中其他成分主要影響異澤蘭黃素的吸收相。見(jiàn)表2、圖4。

3? 討論

優(yōu)良的口服吸收特征是新藥試驗(yàn)篩選過(guò)程中的重要條件，而藥物溶解度和胃腸通透性又是影響口服吸收效率的主要因素。一般來(lái)說(shuō)，藥物的溶解度和滲透性取決于親脂性等因素，但預(yù)測(cè)口服給藥后藥物在人體中的吸收能力相對(duì)復(fù)雜。Caco-2細(xì)胞在體外分化成人體腸道上皮細(xì)胞時(shí)可以表達(dá)腸道特異性水解酶。此外，Caco-2細(xì)胞可以模擬人類腸道中的上皮細(xì)胞表達(dá)P-gp和其他膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，Caco-2細(xì)胞模型常用于探討藥物在人體腸道中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

一般認(rèn)為，Papp值<1×10-6cm/s的化合物被認(rèn)為吸收率低（<30%），Papp值在1×10-6cm/s和1×10-5cm/s之間的化合物被認(rèn)為具有中等吸收（30%～70%），而Papp值>1×10-5 cm/s被認(rèn)為具有高吸收（>70%）[21]。異澤蘭黃素Papp值的結(jié)果表明了其在腸中吸收較差，與口服生物利用度低一致，因此較低的腸道滲透性可能是造成異澤蘭黃素生物利用度低的一個(gè)原因。同時(shí)，異澤蘭黃素吸收的ER>1.5，提示可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

肝臟代謝也是導(dǎo)致口服生物利用度低的一個(gè)重要原因。異澤蘭黃素是黃酮類化合物的一種。事實(shí)上，其他一些常見(jiàn)的黃酮類化合物，如蘆丁[22]和黃芩苷[23]，可以在體內(nèi)發(fā)生強(qiáng)代謝。藥物的體內(nèi)過(guò)程十分復(fù)雜，需要更多的研究來(lái)解釋口服生物利用度低的現(xiàn)象。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，嘗試按大鼠單次給藥的臨床等效劑量（約108 mg/kg坤復(fù)康片）進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)分析體內(nèi)過(guò)程，但由于其入血含量低，在現(xiàn)有LC/MS/MS條件下，無(wú)法在血漿中定量異澤蘭黃素，嘗試在正式實(shí)驗(yàn)中加大給藥劑量（10.58 g/kg）以達(dá)到檢測(cè)目的。因此本藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)未考慮增加劑量對(duì)被測(cè)化合物體內(nèi)過(guò)程的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方成分對(duì)異澤蘭黃素有增加吸收作用。該結(jié)果證明方劑配伍可明顯影響活性化學(xué)成分在體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)行為，說(shuō)明在中醫(yī)辨證理論指導(dǎo)下的復(fù)方配伍原則具有豐富的科學(xué)內(nèi)涵。大多數(shù)中藥單體成分的體外活性弱于天然藥物，如黃芩苷、小檗堿、燈盞花素、丹酚酸等。但絕大部分傳統(tǒng)草藥是通過(guò)口服給藥，這就讓多成分相互作用提高單一成分的生物利用度成為可能。目前，關(guān)于單體聯(lián)合給藥的研究主要集中在藥效學(xué)的關(guān)聯(lián)效應(yīng)上，而關(guān)于藥動(dòng)學(xué)的研究則很少。本研究從小腸吸收及藥動(dòng)學(xué)的角度，為如何提高天然產(chǎn)物生物利用度的問(wèn)題提供新的解決思路及數(shù)據(jù)參考。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[24]，除異澤蘭黃素外，坤復(fù)康片的主要活性成分還包括氧化苦參堿、苦參堿、紅景天苷等，中藥的復(fù)方成分之間的相互作用不局限于吸收階段，對(duì)此將進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2021-03-15）