高燕 李葉 段雪婷 王倩 張海松 李銘

0 引言

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是一種組織特異性自身免疫病，它是除糖尿病外造成成年人腎病綜合征的主要病因[1-3]，也是原發(fā)性腎小球腎炎中導(dǎo)致終末期腎臟病第二位或第三位的病因[4]。MN在各年齡段均可發(fā)病，發(fā)病高峰主要集中在50～60歲[5]。MN的病理改變主要表現(xiàn)為腎小球基底膜不斷增厚，在電鏡下可以觀察到上皮下區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)電子致密沉積物，足細(xì)胞足突融合[6-7]。所以發(fā)現(xiàn)IgG抗體顆粒樣沉積于腎小球毛細(xì)血管袢是MN的診斷依據(jù)[8]。臨床上患者主要表現(xiàn)為腎病綜合征或者無癥狀蛋白尿，蛋白尿量每天超過3.5 g，約有1/3的患者可以自愈，1/3的患者會發(fā)展為終末期腎病，另有1/3的患者表現(xiàn)為持續(xù)存在蛋白尿但腎功能仍可長期維持[1]。

自2002年以來與MN有關(guān)的自身抗原包括中性內(nèi)肽酶(neutral endopeptidase)[9]、M型磷脂酶A2受體(muscle-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)[10]，以及2014年報道的1型血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域7A(thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A)[11]不斷被鑒定出來，為MN的診斷帶來了革命性的變革。但是這些自身抗原的發(fā)現(xiàn)并沒有揭示MN的發(fā)病機(jī)制，所以目前自身抗原對MN的形成發(fā)展機(jī)制尚不明確，因而在臨床上使用昂貴且具有潛在毒性的藥物針對抗原治療MN仍具有很大的挑戰(zhàn)性，也給患者和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

近年來興起的基因芯片以及生物信息學(xué)研究技術(shù)為揭示腎臟疾病的病例機(jī)制提供了新的研究策略。Rudnicki等[12]通過基因芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析揭示了進(jìn)行性腎病的microRNA以及mRNA的表達(dá)譜改變，Ju等[13]則通過對腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)可以作為慢性腎病進(jìn)展的標(biāo)記物。Garantziotis等[14]則通過生物信息學(xué)方法挖掘出一些新的與包括MN在內(nèi)的原發(fā)性腎小球病有關(guān)的藥物靶點(diǎn)。差異表達(dá)的miR-150-5p則被鑒定出來可以預(yù)測IgA腎病的進(jìn)展情況[15]。由此可以看出轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)方法已成為深入研究腎臟相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的有力工具。因此本研究依托GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中MN的相關(guān)表達(dá)芯片數(shù)據(jù)，通過差異基因表達(dá)分析，基因功能注釋、富集分析以及蛋白互作分析，最終獲得與MN密切相關(guān)的基因以及相關(guān)信號通路，為以后揭示MN的分子病理機(jī)制提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在GEO數(shù)據(jù)庫檢索獲得數(shù)據(jù)集GSE108113，該數(shù)據(jù)集以GPL19983 [HuGene-2_1-st] Affymetrix Human Gene 2.1 ST Array [HuGene21st_Hs_ENTREZG_19.0.0] 為平臺，包含280個樣本，其中包含正常腎小球組織6例，正常腎小管組織5例，MN患者腎小球組織44例，MN患者腎小管組織43例，局灶性和節(jié)段性腎小球硬化患者腎小球和腎小管組織共76例，微小病變腎小球和腎小管組織34例，ANCA相關(guān)性小血管炎腎小球和腎小管組織共72例。從中提取獲得6例正常腎小球樣本和44例MN腎小球樣本的數(shù)據(jù)。

1.2 基因表達(dá)分析

首先對獲得的50個樣本進(jìn)行層次聚類分析，檢測樣本之間的相關(guān)性，剔除離群樣本之后對數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。之后通過R包org.Hs.eg.db將芯片探針轉(zhuǎn)換為基因名后，再用R包limma進(jìn)行分析獲取在正常腎小球組織和MN腎小球組織之間差異表達(dá)的基因，設(shè)置篩選條件為P<0.01，且log2FC>2 或 log2FC<-2，并通過R語言對差異表達(dá)基因繪制火山圖和熱圖進(jìn)行展示。

1.3 基因功能注釋以及富集分析

通過R包c(diǎn)lusterProfiler[16]對獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋分析，設(shè)置閾值P<0.01，q<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣的方法也進(jìn)行了KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路分析富集，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 篩選核心基因

將獲得的差異表達(dá)基因?qū)隨TRING(https：//string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置閾值maximum number of interactors=0，confidence score ≥ 0.4，并通過Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，運(yùn)用Cytoscape中的MCODE(molecular complex detection)插件對整個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，篩選得分最高的功能模塊，將其節(jié)點(diǎn)作為核心基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選MN組織與正常組織之間的差異表達(dá)基因

從GEO數(shù)據(jù)庫下載獲得數(shù)據(jù)集GSE108113，通過R軟件從中提取6例正常腎小球組織的數(shù)據(jù)以及44例MN腎小球組織的數(shù)據(jù)，首先對這50例樣本進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)離群樣本GSM2889924[圖1(a)]，將其剔除之后再進(jìn)行PCA分析，兩組樣本聚類結(jié)果一致[圖1(b)]。之后運(yùn)用R軟件里的limma包對兩組樣本進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，通過篩選標(biāo)準(zhǔn)|log2FC|>2，P<0.01，共獲得上調(diào)差異表達(dá)基因36條，下調(diào)差異表達(dá)基因126條。最后對獲得的差異表達(dá)基因繪制火山圖以及熱圖展示其在兩組樣本中的分布，如圖1(c)和圖1(d)所示。

圖1 篩選與MN有關(guān)的差異表達(dá)基因Figure 1 Identification of differentially expressed genes in association with MN

2.2 GO分析

運(yùn)用R軟件里的clusterProfiler包對獲取的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)在“分子功能”(molecular function,MF)方面，差異表達(dá)基因主要富集在珠蛋白結(jié)合、亞鐵血紅素結(jié)合、氧氣結(jié)合、四吡咯結(jié)合以及氧載體活性[圖2(a)]；差異表達(dá)基因在“生物過程”(biological process，BP)方面主要分布在藥物分解代謝以及血小板脫顆粒[圖2(b)]；差異表達(dá)基因富集到的“細(xì)胞組分”(cellular component，CC)主要包括血液微粒(blood microparticle)，細(xì)胞頂端(apical part of cell)及其質(zhì)膜(apical plasma membrane)，囊泡(vesicle lumen)以及胞質(zhì)囊泡(cytoplasmic vesicle lumen)等[圖2(c)]。

圖2 GO條目及其所包含的差異表達(dá)基因Figure 2 Including genes of the GO terms

2.3 KEGG通路分析

同樣通過R軟件里的clusterProfiler包對篩選出來的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果中紅色代表上調(diào)的差異表達(dá)基因富集的通路，其主要富集在吞噬體、瘧疾以及非洲錐蟲；藍(lán)色代表下調(diào)的差異表達(dá)基因富集的通路，其主要富集的信號通路包括細(xì)胞色素P450參與的藥物代謝、視黃醇代謝、PPAR信號通路以及糖代謝、脂肪代謝等。

紅色代表上調(diào)的差異表達(dá)基因富集的通路，藍(lán)色代表下調(diào)的差異表達(dá)基因富集的通路。圖3 KEGG富集分析的結(jié)果Figure 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.4 蛋白互作分析

將獲得的162個差異表達(dá)基因輸入在線網(wǎng)站STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，之后將獲得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化以及后續(xù)分析。最終獲得由60個節(jié)點(diǎn)117條邊構(gòu)成的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體，其余的102個差異表達(dá)基因未被包含到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體中[圖4(a)]。接下來通過Cytoscape中的MCODE插件對所構(gòu)建的整個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類關(guān)聯(lián)分析，設(shè)置參數(shù)degree cutoff=2,node score cutoff=0.2，k-core=2 以及max. depth=100，并選擇分值最高的Cluster作為最終篩選出來的核心基因，該Cluster包含13個節(jié)點(diǎn)25條邊，得分為4.167[圖4(b)]，由此共得到13個核心基因(表1)。

圖4 蛋白互作復(fù)合體Figure 4 PPI network

表1 與MN有關(guān)的核心基因Table 1 The core genes related with MN

3 討論與結(jié)論

MN自然病程長，是一種慢性病，而近年來在我國PM2.5污染嚴(yán)重的城市MN的發(fā)病率升高明顯，已成為繼IgA腎病之后第二大原發(fā)性腎小球病[17]，給社會經(jīng)濟(jì)以及人們的日常生活帶來沉重負(fù)擔(dān)。因而揭示MN的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)成為急需解決的醫(yī)學(xué)問題。本研究通過生物信息學(xué)方法提取并分析了GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集GSE108113中關(guān)于MN的數(shù)據(jù)，最終獲得與MN密切相關(guān)的13個核心基因以及藥物代謝、視黃醇代謝等相關(guān)信號通路。

CYP3A5(cytochrome P450 family 3 subfamily A member 5)，CYP4A11(cytochrome P450 family 4 subfamily A member 11)，CYP2B6(cytochrome P450 family 2 subfamily B member 6)均屬于細(xì)胞色素P450家族，這3個基因廣泛參與到藥物代謝過程，在本研究中還富集到了視黃醇代謝過程。Déri等[18]也報道了在終末期腎病患者的腎組織里面細(xì)胞色素P450家族的基因表達(dá)下調(diào)，與本研究的變化趨勢一致，說明了細(xì)胞色素P450家族在腎病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。另外被富集到這2個通路的核心基因還有GSTA2(glutathione S-transferase alpha 2)和UGT1A6(UDP glucuronosyltransferase family 1 member A6)。GSTA2屬于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶家族，是II期解毒酶家族。Kim等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)非馬沙坦防治腎臟纖維化可能是通過上調(diào)GSTA2以降低腎臟的氧化損傷，因而高水平表達(dá)的GSTA2對于腎臟具有保護(hù)作用。UGT1A6則屬于UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1家族的一員，它可以將激素、藥物等降解為水溶性的排泄物。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)肝臟及腎臟的葡萄苷酸化作用很大程度上受到該家族基因表達(dá)的影響。因而UGT1A6表達(dá)降低可能會影響腎臟的正常功能。

其他的核心基因像NT5E(5′-nucleotidase ecto)是一種核苷酸酶，也參與藥物的代謝。而Cappelli等[21]也觀察到TGF-β可以激活腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)NT5E以促進(jìn)腎臟纖維化，而在糖尿病腎病患者尿液中NT5E含量升高可以作為預(yù)后不良的指標(biāo)。激肽原1(KNG1，kininogen 1)在GO分析中被注釋到血液微粒、血小板脫顆粒以及胞質(zhì)囊泡中。Tang等[22]通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)KNG1與糖尿病患者的腎小管損傷有關(guān)。

本研究揭示了以CYP3A5、CYP4A11、CYP2B6

為代表的13個核心基因表達(dá)異常，以及藥物代謝和視黃醇代謝通路與MN之間存在的密切關(guān)聯(lián)。然而這些基因表達(dá)異常與MN發(fā)展形成的病理分子機(jī)制還有待深入研究。同時本研究中只選取一個數(shù)據(jù)集中的部分合適樣本，研究有一定局限性，后續(xù)還需要有更多的實(shí)驗數(shù)據(jù)驗證支持。本研究將為闡釋MN發(fā)生的病理機(jī)制提供新的研究視角和研究基礎(chǔ)。