王玲玲，吳宗丙，羅繼敏，朱勝章，劉運(yùn)麟

（1.黔南州人民醫(yī)院病理科，貴州 黔南 550008；2.黔南州中醫(yī)院病理科，貴州 黔南 550008）

宮頸癌（cervical cancer）是臨床常見的惡性腫瘤之一，也是目前病因明確且可進(jìn)行早期診斷和治療的惡性腫瘤之一[1]。但是目前臨床尚未形成統(tǒng)一的預(yù)防和篩查宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)，其漏診、誤診率較高[2]。研究顯示[3]，宮頸癌患者癌變組織中幾乎都有人乳頭狀瘤病毒（HPV）的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)HPV 感染也是引起宮頸癌的重要因素。由此可見，HPV 感染可能是宮頸癌的啟動(dòng)因子，圍繞HPV 開展相關(guān)生物學(xué)研究，了解基因表達(dá)情況，對(duì)宮頸癌癌前病變轉(zhuǎn)化具有重要的價(jià)值[4]。E6 或E7 基因是HPV 主要致癌基因，其荷載量、表達(dá)水平等都被認(rèn)為是癌變進(jìn)展的重要生物學(xué)預(yù)警指標(biāo)[5]。目前，臨床關(guān)于HR-HPV 載量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宮頸癌和癌前病變中表達(dá)情況的相關(guān)研究較少，其表達(dá)水平與宮頸癌的相關(guān)性還需要不斷探索[6]。本研究結(jié)合2020 年5月-2021 年5 月在我院診治的89 例HPV 持續(xù)感染患者的臨床資料，探究HR-HPV 載量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宮頸癌和癌前病變的表達(dá)和意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年5 月-2021 年5 月在黔南州人民醫(yī)院診治的89 例HPV 持續(xù)感染患者為研究對(duì)象，年齡33～64 歲，平均年齡（46.12±2.93）歲。依據(jù)病理組織分為宮頸癌組（n=33）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ組（n=19）、CINⅡ組（n=17）、CINⅢ組（n=20），各組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合臨床宮頸癌前病變CIN 和宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②均經(jīng)病理學(xué)診斷確診[8]；③納入患者均為女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；②合并惡性腫瘤、自身免疫學(xué)疾?。虎跦IV 陽(yáng)性[9]；④合并子宮或?qū)m頸切除史。

1.3 方法 各組患者分別進(jìn)行HR-HPV 載量、HRHPV E6 或E7 mRNA 檢測(cè)。

1.3.1 HR-HPV 載量 采用PCR 熒光法，應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀（Genesy96T，天隆科技）和HR-HPV 核酸定量檢測(cè)試劑盒，試劑盒均由上海生物科技有限公司提供，主要包括16、18、31、33、45、52、56、58 型。于月經(jīng)后半周期進(jìn)行取樣，采用陰道窺器暴露宮頸陰道部，干棉球拭凈宮頸口過多黏液、血液、分泌物，貼緊宮頸口，將刷頭置于宮頸管，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5 圈，停留5 s 取出，取下刷頭，浸泡于含液基細(xì)胞學(xué)保存液的瓶中送檢[10]。所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，依據(jù)HR-HPV 載量分組：低載量組：104～105copies/ml；中載量組：105～106copies/ml；高載量組：106～107copies/ml；超高載量組：＞107copies/ml[11]。

1.3.2 HR-HPV E6 或E7 mRNA 采用QuantiVirusTM便攜式冷光儀和HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)試劑盒，試劑盒有北京生物有限公司提供，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 共14 型。應(yīng)用支鏈DNA 信號(hào)擴(kuò)增法，先將樣品離心5 min，去上清液，加入2 ml 雙蒸水清洗，再次離心，去上清液，加入裂解液混勻，再加入蛋白酶K，65 ℃孵育1 h，留取上清，再經(jīng)過布板、信號(hào)放大、添加底物等過程后[12]，采用冷光儀檢測(cè)，得到光子數(shù)后經(jīng)軟件轉(zhuǎn)化為mRNA 拷貝數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo) 比較各組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 檢出陽(yáng)性率和表達(dá)水平；分析不同HR-HPV 載量（低載量、中載量、高載量、超高載量）的不同類型宮頸病發(fā)生率以及不同宮頸病變與HR-HPV 載 量、HR-HPV E6 或E7 mRNA的 相關(guān)性。

1.4.1 CIN 分級(jí)[13]CINⅠ：輕度非典型增生，排列不整齊，但仍保持極性，異常增生細(xì)胞僅占上皮層1/3；CINⅡ：中度非典型增生，排列較紊亂，異常增生細(xì)胞占上皮層的2/3；CINⅢ：重度非典型增生，失去極性，異常增生細(xì)胞擴(kuò)展至上皮層的2/3 以上。

1.4.2 檢出陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)[14]HPV DNA：如果增長(zhǎng)曲線不呈S 型或循環(huán)閾值（Ct）為空白，則判樣品的HPV DNA 總含量小于檢測(cè)下限，如果增長(zhǎng)曲線呈S 型且Ct 值＜40，HPV DNA＞103copies/ml 為陽(yáng)性；mRNA拷貝數(shù)≥1 copy/ml 為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 21.0 版本對(duì)本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；使用Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA檢出陽(yáng)性率比較 各組HR-HPV DNA 陽(yáng)性率均大于陰性率，宮頸癌組、CINⅡ組、CINⅢ組HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率均大于陰性率，CINⅠ組陽(yáng)性率小于陰性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CINⅡ組HR-HPV DNA 載量陽(yáng)性率與HR-HPV E6 或E7 mRNA 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；宮頸癌組、CINⅢ組HR-HPV DNA 陽(yáng)性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率均大于CINⅠ組、CINⅡ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），宮頸癌組HR-HPV DNA 陽(yáng)性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率與CINⅢ組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CINⅡ組HR-HPV DNA 陽(yáng)性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率大于CINⅠ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 檢出陽(yáng)性率比較[n（%）]

2.2 各組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表達(dá)水平比較 宮頸癌組、CINⅡ組、CINⅢ組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平均高于CINⅠ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；宮頸癌組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平與CIN Ⅲ組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CINⅠ組HR-HPV DNA 載量水平與CINⅡ組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CINⅡ組HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平高于CINⅠ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表達(dá)水平比較（）

表2 各組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表達(dá)水平比較（）

注：與CINⅠ組比較，*P＜0.05；與CINⅢ組比較，△P＞0.05；與CINⅡ組比較，**P＞0.05，△△P＜0.05

2.3 不同HR-HPV 載量的患者不同類型宮頸病變發(fā)生率比較 不同HR-HPV 載量的患者CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌的發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同HR-HPV 載量的患者不同類型宮頸病變發(fā)生率比較[n（%）]

2.4 不同宮頸病變患者HR-HPV DNA 和HPV E6 或E7 mRNA的相關(guān)性 CINⅠ、CINⅡ患者中HPV E6或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 均呈正相關(guān)（r=0.431、0.709，P=0.000、0.000），CIN Ⅲ與宮頸癌患者中HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 無相關(guān)性（r=0.152、0.089，P=098、0.432）。

3 討論

宮頸癌生物標(biāo)志物多種多樣，常規(guī)HPV 基因檢測(cè)靈敏度高，可一定程度降低宮頸癌漏診率[15]。但是由于HPV 感染的普遍性和自限性，導(dǎo)致HPV 分型鑒別特異度低，僅能提示感染，不能準(zhǔn)備判斷是否存在宮頸病變，更無法對(duì)其嚴(yán)重程度進(jìn)行準(zhǔn)確判斷[16]。因此，臨床缺乏前瞻性預(yù)判指標(biāo)，可能會(huì)錯(cuò)過CIN到浸潤(rùn)癌的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。E6 或E7 基因是HPV 主要致癌基因，HPV 感染后可將E6/E7 DNA 整合至宮頸上皮細(xì)胞基因，使其獲得基因E6/E7 DNA，并進(jìn)一步激活，通過宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄出E6/E7 mRNA，進(jìn)一步翻譯為癌蛋白E6/E7 DNA[17]。因此，HR-HPV 載量和HR-HPV E6 或E7 mRNA 在宮頸癌和癌前病變的表達(dá)具有重要的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，各組HR-HPV DNA 陽(yáng)性率均大于陰性率，宮頸癌、CINⅡ、CINⅢ各組HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率均大于陰性率，CINⅠ組陽(yáng)性率小于陰性率（P＜0.05），CINⅡ組HR-HPV DNA載量陽(yáng)性率與HR-HPV E6 或E7 mRNA 基本一致（P＞0.05），提示在比CINⅠ高等級(jí)的宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率均大于陰性率。同時(shí)，各組HR-HPV DNA 陽(yáng)性率均大于陰性率，但是CINⅡ組和CINⅠ組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），進(jìn)一步表明HR-HPV DNA 和HRHPV E6 或E7 mRNA 參與宮頸癌發(fā)展，與宮頸病變程度密切相關(guān)，但是HR-HPV DNA 和HR-HPV E6或E7 mRNA 載量與疾病程度有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，宮頸癌組、CINⅢ組HR-HPV DNA 陽(yáng)性率、HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率均大于CINⅠ組、CINⅡ組（P＜0.05），宮頸癌組與CINⅢ組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但CINⅡ組大于CINⅠ組（P＜0.05），表明隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變等級(jí)的升高，HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率有升高的趨勢(shì)，但是CINⅢ和宮頸癌差異不明顯。因此，臨床可通過檢測(cè)HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 陽(yáng)性率對(duì)宮頸癌和癌前病變進(jìn)行篩查，初步對(duì)宮頸病變進(jìn)行分級(jí)。宮頸癌組、CINⅡ組、CINⅢ組HR-HPV DNA 載量、HR-HPV E6 或E7 mRNA水平均高于CINⅠ組（P＜0.05），宮頸癌組與CINⅢ組比較、CINⅠ組HR-HPV DNA 載量水平與CINⅡ組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CINⅡ組HR-HPV E6 或E7 mRNA 水平高于CINⅠ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明HR-HPV DNA、HRHPV E6 或E7 mRNA 表達(dá)水平在不同疾病程度中的表達(dá)不同。但是在CINⅠ和CINⅡ之間存在的差異，而CINⅢ和宮頸癌之間差異不明顯。分析認(rèn)為可能由于CINⅢ患者的HR-HPV DNA、HR-HPV E6或E7 mRNA 已經(jīng)處于較高水平表達(dá)，與宮頸癌存在較多的交叉重疊情況，從而差異分布不顯著[18]。因此，臨床可通過檢測(cè)HR-HPV DNA、HR-HPV E6 或E7 mRNA 表達(dá)水平，來鑒別宮頸癌與癌前病變，為臨床的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。

本研究顯示，不同HR-HPV 載量患者CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌的發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明不同HR-HPV 載量的患者不同宮頸病變比例存在差異，其中超高載量的患者變化最為明顯。分析認(rèn)為可能是由于宮頸癌病毒載量相對(duì)較高，其變化趨勢(shì)相對(duì)更顯著[19]。此外，HPV E6或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 間存一定的相關(guān)性，在CINⅠ、CINⅡ患者中，HPV E6 或E7 mRNA 與HR-HPV DNA 呈正相關(guān)，CINⅢ與宮頸癌患者中兩者無相關(guān)性，該結(jié)論與吳萍等[20]的報(bào)道相似。因此，臨床定量測(cè)定HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA，可一定程度提高宮頸病變的靈敏度，但是具體的診斷效能還需要進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)。

綜上所述，對(duì)于持續(xù)HPV 感染的患者，應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HPV E6 或E7 mRNA 和HR-HPV DNA 水平；對(duì)于較高HPV 負(fù)荷的患者，通常提示高級(jí)別（CINⅡ以上）以及嚴(yán)重宮頸病變可能性增加，需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和隨訪，以最大化提高HPV 清除率，改善患者預(yù)后。