董路，張譽(yù)方，蒙英雯，衡昭君，孫峰，周惠芬，李建昌，李晶，徐聰*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.元江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 元江 653300；3.元江縣紅河街道農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，云南 元江 653300； 4.玉溪市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 玉溪 653100)

近年來(lái)，隨著養(yǎng)羊業(yè)的迅速發(fā)展，羊腸道寄生蟲病的危害日趨嚴(yán)重，并成為影響?zhàn)B羊業(yè)健康發(fā)展的常見疾病之一。長(zhǎng)期以來(lái)，羊腸道寄生蟲感染較為普遍，雖然能在其糞樣檢查中發(fā)現(xiàn)蟲卵，但大多為帶蟲者不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，從而極易被人們忽視[1]。腸道寄生蟲在宿主體內(nèi)掠奪宿主營(yíng)養(yǎng)、造成宿主機(jī)械性損傷、毒素作用和免疫損傷以及繼發(fā)性感染[2]，從而導(dǎo)致羊生長(zhǎng)發(fā)育受阻，影響產(chǎn)品質(zhì)量，甚至誘發(fā)其他傳染病及人畜共患病等。羊腸道寄生蟲病嚴(yán)重阻礙養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，有效控制羊寄生蟲病的發(fā)生，促進(jìn)養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)提高養(yǎng)羊業(yè)的生產(chǎn)效益和減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

在云南，山羊感染的腸道寄生蟲主要包括線蟲、球蟲、絳蟲和吸蟲，且有感染率高、感染強(qiáng)度大、分布廣等特點(diǎn)[3，4]。趙阿普等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)怒江州山羊寄生蟲蠕蟲感染率達(dá)到100%，線蟲、吸蟲和絳蟲感染率分別為97.61%、78.57%和9.52%；瀘西縣山羊腸道寄生蟲感染率為94.2%[5]；昆明市北郊山羊胃腸道寄生蟲感染率為100%[6]；大理州部分地區(qū)總體感染率為82.4%[7]。元江縣地處低緯度，屬季風(fēng)氣候，空氣濕度大，降水量多，這為動(dòng)物腸道寄生蟲病的定殖創(chuàng)造了良好的條件。目前，針對(duì)玉溪市元江縣有關(guān)山羊腸道寄生蟲病的報(bào)道較少。因此，為了解元江縣部分地區(qū)山羊腸道寄生蟲種類和感染情況，于2021年4—5月對(duì)元江縣2個(gè)采樣點(diǎn)6個(gè)不同養(yǎng)殖場(chǎng)采集的168份山羊糞樣進(jìn)行了腸道寄生蟲感染情況的初步調(diào)查。本研究不僅為玉溪市山羊腸道寄生蟲病的科學(xué)防控提供了數(shù)據(jù)支撐，也對(duì)進(jìn)一步評(píng)估當(dāng)?shù)氐墓残l(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn)具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1糞便樣品采集

從元江縣2個(gè)采樣點(diǎn)6個(gè)不同養(yǎng)殖場(chǎng)共采集168份新鮮山羊糞便樣品。將采集的糞便樣品分別裝入潔凈的保鮮袋內(nèi)，標(biāo)明采樣地、性別、年齡和編號(hào)等信息，4℃保存待檢。

1.1.2主要器材

光學(xué)生物顯微鏡、10mL青霉素瓶、燒杯、60目篩網(wǎng)、載玻片、玻棒、鐵架臺(tái)、漏斗、麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板、電子天平、離心機(jī)、漩渦振蕩器、微波爐、恒溫水浴鍋、PCR儀、電泳儀、Eppendorf微量移液槍、凝膠成像系統(tǒng)、超純水器等。

1.1.3主要試劑

飽和食鹽水，糞便DNA提取試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)，Gel Stain核酸染料(全式金)，6×Loading Buffer，DL2000Marker，Ex Taq DNA聚合酶(均購(gòu)自TaKaRa公司)，50×TAE緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制)，瓊脂粉(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1蟲卵種類鑒定

采用飽和鹽水漂浮法對(duì)糞便樣品進(jìn)行處理，在顯微鏡下觀察卵囊或蟲卵的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小、顏色及卵殼和內(nèi)容物等特征，并對(duì)照寄生蟲標(biāo)準(zhǔn)圖譜和相關(guān)參考文獻(xiàn)[8]鑒別卵囊或蟲卵的種類。

1.2.2感染強(qiáng)度測(cè)定

將顯微鏡下觀察到的陽(yáng)性樣本用麥克馬斯特(McMaster’s method)蟲卵計(jì)數(shù)法測(cè)定每克糞便中的原蟲卵囊數(shù)(Oocyst per gram，OPG)和線蟲蟲卵數(shù)(Eggs per gram，EPG)。分別測(cè)定糞便樣品中球蟲和線蟲的感染強(qiáng)度。

1.2.3巢式PCR檢測(cè)

嚴(yán)格按照OMEGA糞便DNA提取試劑盒(EZNAR stool DNA Kit試劑盒,型號(hào)：D4015-02)說明書提取糞樣DNA。采用巢式PCR對(duì)168份樣品分別基于畢氏腸微孢子蟲的ITS基因和芽囊原蟲、隱孢子蟲的SSU rRNA基因進(jìn)行檢測(cè)。三種腸道原蟲巢式PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，擴(kuò)增條件按陶威等[9]和Karim等[10]的文獻(xiàn)擴(kuò)增。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳和PCR產(chǎn)物測(cè)序

微孢子蟲采用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，隱孢子蟲和芽囊原蟲均采用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件均為110V、30min。電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。將接近目的條帶的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST在線同源性比對(duì)，進(jìn)而確定3種腸道原蟲的種類。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(X2)，計(jì)算P值，比較不同采樣點(diǎn)、年齡、性別因素間山羊腸道寄生蟲感染率的差異。當(dāng)P>0.05 時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著；當(dāng)P<0.05時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；當(dāng)P<0.01時(shí)，則統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 腸道寄生蟲總體感染情況

本次對(duì)元江縣168份山羊糞便樣品腸道寄生蟲檢測(cè)的結(jié)果顯示，元江縣山羊腸道寄生蟲總感染率為44.64%，以球蟲和線蟲感染為主(部分卵囊或蟲卵形態(tài)如圖1)；其中球蟲感染率為44.64%(75/168)，線蟲感染率為3.57%(6/168)，混合感染率為3.57%(6/168)；不同采樣點(diǎn)間感染率差異極顯著(P<0.01)。麥克馬斯特氏蟲卵計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，OPG值在0～23800，平均為883.33，EPG值在0～200，平均為7.14，見表1。

A：球蟲卵囊；B：線蟲蟲卵；10×10。

表1 元江縣部分地區(qū)山羊腸道寄生蟲感染情況與感染強(qiáng)度

2.2 不同年齡、性別羊的腸道寄生蟲感染情況

1歲以下山羊球蟲感染率最低(6.55%)，1～2歲球蟲感染率最高(22.62%)；2歲及以上山羊線蟲感染率最低(0.60%)；不同年齡段間感染率差異不顯著(P>0.05)。母山羊球蟲感染率最高(29.76%)，公山羊感染率為14.78%；線蟲感染率相同(1.79%)，不同性別間感染率差異不顯著(P>0.05)，見表 2。

表2 不同年齡、性別腸道寄生蟲感染情況

2.3 巢式PCR檢測(cè)結(jié)果

采用巢氏PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，168份糞樣中有9份檢測(cè)為陽(yáng)性，總感染率為5.36%(9/168)，其中畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率分別為4.76%(8/168)和0.60%(1/168)，未檢測(cè)到隱孢子蟲感染，見表3。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在250～2000bp出現(xiàn)兩個(gè)單一且明顯條帶，與畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的目的片段392bp和1100bp大小相符，見圖2。

表3 元江縣部分地區(qū)山羊腸道寄生蟲巢式PCR檢測(cè)結(jié)果

M:DL 2000 DNA Marker；1—4:畢氏腸微孢子蟲；6:芽囊原蟲；5、7:陰性對(duì)照。

3 討論

3.1 山羊腸道寄生蟲感染情況

在四大群發(fā)病中(傳染病、代謝病、中毒病、寄生蟲病)，寄生蟲病是一種慢發(fā)性疾病，且發(fā)病后大多不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此容易被人們忽視[11]。常見的腸道寄生蟲主要包括線蟲、球蟲、絳蟲和吸蟲，感染后主要造成宿主腹瀉、腸道阻塞、貧血、消瘦及皮膚過敏等癥狀[12]，從而嚴(yán)重阻礙羊的生長(zhǎng)繁育，影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展。

本次調(diào)查結(jié)果顯示，元江縣部分山羊腸道寄生蟲以線蟲和球蟲感染為主，總感染率為44.64%。其中，球蟲感染率為44.64%，線蟲感染率為3.57%，混合感染率為3.57%。OPG值最高為23800，平均為883.33；EPG值最高為200，平均為7.14。本調(diào)查結(jié)果均低于以下報(bào)道結(jié)果，但優(yōu)勢(shì)蟲種與報(bào)道一致。朱丹等[13]、鄭玲等[14]和曹樹軒等[15]報(bào)道了我國(guó)部分地區(qū)山羊腸道寄生蟲總感染率均在80%以上，優(yōu)勢(shì)感染蟲種以球蟲和線蟲為主，感染強(qiáng)度和混合感染率顯著高于本調(diào)查結(jié)果。同時(shí)，該結(jié)果也低于重慶[16]、江西[17]、烏魯木齊[18]等地報(bào)道結(jié)果。分析其原因，一是可能與近年來(lái)元江縣養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)加快養(yǎng)殖場(chǎng)地規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，不斷加大疫病防控力度和相關(guān)山羊寄生蟲病的防治宣傳有關(guān)；而球蟲感染相對(duì)較為嚴(yán)重，這可能與放養(yǎng)羊群更易接觸到外界環(huán)境中含有卵囊或幼蟲的飼草和飲水有關(guān)。此外，該地區(qū)的養(yǎng)殖戶大多為本地居民，未經(jīng)專業(yè)養(yǎng)殖培訓(xùn)，對(duì)寄生蟲的防控意識(shí)淡薄。二是可能散養(yǎng)戶做過一些預(yù)防工作(如定期驅(qū)蟲等)，雖然這些驅(qū)蟲藥物對(duì)蠕蟲有一定的效果，但對(duì)球蟲沒有明顯的效果。

3.2 不同采樣點(diǎn)、年齡、性別腸道寄生蟲感染情況

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，a、b兩地山羊球蟲和線蟲感染率分別為32.50%、2.50%和75.00%、6.25%，不同采樣點(diǎn)間山羊感染率差異極顯著(P<0.01)。從調(diào)查結(jié)果分析，這2種寄生蟲在元江縣山羊群體中均存在感染，究其原因可能是元江地處低緯度，溫暖潮濕，為腸道寄生蟲的體內(nèi)外發(fā)育創(chuàng)造了有利的條件和機(jī)會(huì)。1歲以下山羊球蟲感染率最低(6.55%)；1～2歲感染率最高(22.62%)；2歲及以上山羊線蟲感染率最低(0.60%)；不同年齡段間感染率差異不顯著(P>0.05)。有文獻(xiàn)[19，20]報(bào)道，羊在不同年齡階段消化道寄生蟲感染程度有所不同，其原因可能是羔羊與外界環(huán)境接觸較少，而成年羊主要以麥秸、青貯玉米等粗飼料為主，因此，增加了寄生蟲感染的機(jī)會(huì)。調(diào)查結(jié)果顯示，母山羊球蟲感染率最高(29.76%)，公山羊感染率為14.88%，公、母山羊線蟲感染率相同；不同性別間感染率差異不顯著(P>0.05)，這可能與當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境和飼養(yǎng)管理有關(guān)。

3.3 山羊腸道原蟲感染情況

此次調(diào)查結(jié)果顯示，在168份山羊糞樣中共檢測(cè)出9份腸道原蟲陽(yáng)性，陽(yáng)性率為5.36%，包括8份畢氏腸微孢子蟲和1份芽囊原蟲，陽(yáng)性率分別為4.76%、0.60%，未檢測(cè)出隱孢子蟲感染。我國(guó)寧夏[21]、甘肅[22]地區(qū)的羊畢氏腸微孢子蟲的感染率分別為14.48%和34.46%；甘肅[22]、安徽[23]地區(qū)羊隱孢子蟲的感染率分別為4.52%和0.26%；據(jù)Li W C等[24]、謝世臣等[25]報(bào)道，我國(guó)部分地區(qū)和云南羊芽囊原蟲感染率為0.3%、41.3%。國(guó)外，Udonsom R等[26]、Geurden T等[27]、Tan T C等[28]報(bào)道了山羊畢氏腸微孢子蟲感染率為19.2%，隱孢子蟲的感染率為9.5%，芽囊原蟲感染率為30.9%。畢氏腸微孢子蟲、芽囊原蟲和隱孢子蟲均為重要的人獸共患機(jī)會(huì)性和致病性腸道原蟲[9]，3種腸道原蟲呈世界性分布。本次調(diào)查的3種腸道原蟲感染率均低于國(guó)內(nèi)外的報(bào)道結(jié)果，究其原因，這3種腸道原蟲感染率的差異，可能與飼養(yǎng)方式、不同品種、飼養(yǎng)衛(wèi)生條件、采樣季節(jié)、山羊年齡存在密切的關(guān)系。