劉恩寵,田 原,韋 瑤,馬成俊,王振華

(煙臺大學生命科學學院,線粒體與健康衰老研究中心,山東 煙臺 264005)

慢性腦低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是指動脈硬化等多種原因引發(fā)的長期腦血流灌注不足,可致漸進性認知功能障礙,已成為老年人群高發(fā)腦血管病。CCH也可增加阿爾茨海默癥癡呆風險,并參與了腦卒中所致的血管性癡呆進展[1-2]。目前CCH致認知功能障礙的確切機制仍未完全闡明,亦未有理想的臨床干預措施。理想的CCH動物模型對于揭示其病理機制,篩選防治藥物十分必要[3]。SHIBATA等[4]于2004年采用內(nèi)徑為0.18～0.22 mm的不銹鋼微型彈簧,套于成年C57BL/6小鼠雙側(cè)頸總動脈,通過單次手術(shù)成功復制了雙側(cè)頸總動脈狹窄致CCH小鼠模型,已成為較為經(jīng)典的CCH模型復制方法。

毛蕊花苷(Verbascoside,VB)是廣泛存在于肉蓯蓉、馬先蒿等植物藥資源中的苯乙醇苷類化合物[5]。已有研究發(fā)現(xiàn),毛蕊花苷具有明確的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、神經(jīng)保護、改善記憶障礙等廣泛生理活性[6]。毛蕊花苷可以改善缺氧所致小鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷以及海馬體內(nèi)的氧化脅迫狀態(tài)[7],LI等也證實毛蕊花苷可改善模擬高原低氧所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷及記憶功能損害,或與其調(diào)節(jié)腦組織氧化應激和mTOR信號通路有關(guān)[8]。

我國已于2018年將荒漠肉蓯蓉(CistanchedeserticoLa Y. C. Ma)納入藥食同源目錄,已有文獻報道,自管花肉蓯蓉制備的蓯蓉總苷富含松果菊苷(44.3%),對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠短期內(nèi)(7 d)的記憶缺陷有明確保護作用[9]。肉蓯蓉中富含的毛蕊花苷是否可改善慢性腦低灌注所致認知功能損害,尚未見明確報道。本研究建立了不銹鋼微彈簧致小鼠雙側(cè)頸總動脈狹窄致全腦低灌注模型,成功復制了CCH小鼠認知功能損害模型,考察了于飲水中添加毛蕊花苷提取物對小鼠認知功能障礙的改善作用,以期為基于肉蓯蓉的相關(guān)功能食品開發(fā)提供可借鑒的思路。

1 材 料

1.1 實驗動物

健康雄性ICR小鼠,體重18～22 g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物合格證號:SCXK(魯)20140007。飼養(yǎng)于煙臺大學實驗動物中心,12 h晝夜明暗交替,室溫23～25 ℃,相對濕度40%～60%,自由攝食飲水。小鼠飼以滅菌顆粒飼料和滅菌用純凈水。適應飼養(yǎng)一周,之后開始正式實驗。

1.2 實驗藥品與試劑

新疆荒漠肉蓯蓉由新疆凱美嘉生物科技有限公司提供,采收自新疆和田地區(qū)。參考文獻方法[10]獲得肉蓯蓉苯乙醇苷類粗提取物,再按文獻方法[11]經(jīng)中壓柱層析獲得毛蕊花苷部位,HPLC鑒定提取部位含毛蕊花苷85.3%;水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠);青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司);非吸收性外科縫線4-0(揚州源康醫(yī)療器械有限公司);生理鹽水(山東科倫藥業(yè)有限公司);甲苯胺藍O(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司);BSA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);AChE測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);SOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);MDA測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。304不銹鋼微型彈簧,購自永嘉縣智翔五金有限公司,線徑0.08 mm,外徑0.35 mm,長度5.0 mm。

2 方 法

2.1 微彈簧致雙側(cè)頸總動脈狹窄復制小鼠CCH模型

小鼠30只,禁食過夜后,按體重隨機分為2組,每組15只。腹腔注射水合氯醛400 mg/kg麻醉后,仰臥位固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺,碘伏和75%酒精消毒皮膚,沿小鼠頸部中線皮膚剪開一條2 cm的小口,鈍性剝離結(jié)締組織及頜下腺,分離兩側(cè)頸總動脈。解剖鏡下將微彈簧繞頸總動脈旋轉(zhuǎn)推進至套于血管外側(cè)[4],兩側(cè)均套置成功后,縫合創(chuàng)口,同時腹腔注射5萬單位青霉素鈉,以防感染。小鼠置37 ℃恒溫孵育箱待蘇醒后,常規(guī)飼養(yǎng),每籠3只動物。假手術(shù)組小鼠除兩側(cè)頸總動脈不套置微彈簧外,其他手術(shù)過程同CCH模型組小鼠。

2.2 模型驗證

2.2.1 甲苯胺藍O灌注染色考察腦低灌程度 小鼠造模后24 h,水合氯醛麻醉,仰臥位固定于37 ℃恒溫手術(shù)臺,開胸暴露心臟,止血鉗鉗夾心尖部位固定心臟,剪開右心耳,自左心室灌注10 mL生理鹽水,沖洗排除血管內(nèi)血液,再于左心室緩慢灌注(30 s)5 mL 0.1%的甲苯胺藍O生理鹽水溶液,作為組織灌流指示劑,隨即沿顱骨中縫打開顱骨,小心剝離全腦,生理鹽水沖洗粘附血液,濾紙吸干水分,稱重,置于小鼠腦切片模具(東莞市捷凱精工電子有限公司),冠狀切成2 mm厚腦片,前切面向下順序放置于培養(yǎng)皿中,于凝膠成像系統(tǒng)(上海天能5200Multi)反射可見光條件下拍照。另外,收集腦片,加入9倍量生理鹽水,手持式電動組織勻漿器(德國IKA T10)勻漿,5000×g離心10 min,每樣品取上清150 μL,加于96孔板,于540 nm檢測波長下測定每孔光吸收,基于標準曲線計算單位腦質(zhì)量甲苯胺藍O含量,定量表征腦組織甲苯胺藍灌注水平,以反映全腦灌注水平。

2.2.2 Morris水迷宮考察學習記憶 微彈簧致小鼠CCH造模后4個月,Morris水迷宮考察小鼠認知功能。訓練前兩日,平臺位于水面以上1 cm,第1天將小鼠置于水中平臺停留30 s以熟悉訓練環(huán)境,第2天將小鼠從4個象限分別放入迷宮,等小鼠尋找到平臺,并在平臺停留10 s,若在120 s之內(nèi)仍未找到平臺,則引導小鼠至平臺并停留10 s;隨后進行連續(xù)5 d的定位航行實驗,將小鼠從每象限中點背靠迷宮壁放入水中,記錄小鼠尋找至平臺時間(逃避潛伏期),如果120 s內(nèi)小鼠仍未找到平臺,則引導此小鼠至平臺停留15 s,將其逃避潛伏期記為120 s,每象限訓練間隔時間30 s。在隨后的空間探索實驗中,撤掉平臺,隨機選定兩個非目標象限,輪流將小鼠放于迷宮,記錄小鼠于2 min內(nèi)穿越原平臺位置次數(shù)、不同象限停留時間及其游泳路程,計算小鼠在目標象限停留時間及游泳路程百分比,以表征小鼠長時程空間學習記憶情況。實驗中平臺位置及參照物保持不變,水溫設定為25 ℃,小鼠訓練結(jié)束后,吸水紙和毛巾擦干,原籠飼養(yǎng)。

2.3 肉蓯蓉毛蕊花苷提取物對腦低灌注小鼠認知功能影響評價

本研究中,模型組小鼠造模70只,禁食過夜后隨機選取12只作為假手術(shù)組,余58只按2.1方法復制小鼠CCH模型。造模組于第2日隨機分為CCH模型組、毛蕊花苷提取物低、中、高劑量組,各組小鼠分籠飼養(yǎng),每籠3只?？紤]本研究所復制小鼠CCH模型于雙側(cè)頸總動脈套置不銹鋼彈簧,長期灌胃抓握小鼠可能導致小鼠頸總動脈機械損傷,加之肉蓯蓉已作為藥食同源植物,安全性較高,且本研究旨在為肉蓯蓉提取物作為功能飲品開發(fā)提供借鑒,因此研究采用于飲水中添加毛蕊花苷提取物方式給予小鼠,添加質(zhì)量濃度分別為0.16、0.32和0.64 g/L,毛蕊花苷提取物溶解于無菌純凈水后,0.22 μm除菌濾膜過濾后使用,每日定時更換新鮮配制的毛蕊花苷提取物溶液。假手術(shù)組和CCH模型組給予無菌純凈水。于給予毛蕊花苷提取物4個月后,按“2.2.2”中的方法,Morris水迷宮測定各組小鼠空間學習記憶能力。

2.4 海馬組織乙酰膽堿酯酶活力及氧化應激指標檢測

行為學實驗結(jié)束后,斷頸處死小鼠,迅速取腦,分離兩側(cè)海馬組織,精確稱重后,加入9倍量生理鹽水,冰浴條件勻漿,4 ℃下5000×g離心10 min,取上清液,按照試劑盒方法測定各組小鼠海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶(AChE)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)水平。采用BCA蛋白定量試劑盒測定上清總蛋白濃度,進一步校準AChE、SOD活力和MDA水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié) 果

3.1 微彈簧致雙側(cè)頸總動脈狹窄成功復制小鼠全腦低灌注模型

為驗證單次手術(shù)兩側(cè)頸總動脈套置微彈簧對小鼠腦灌注的影響,利用甲苯胺藍O染液灌注后,觀察腦組織染色情況,結(jié)果如圖1所示。假手術(shù)組小鼠腦組織對甲苯胺藍O均有明顯著色,腦白質(zhì)著色最深,CCH模型組小鼠全腦著色明顯降低。圖1中定量比色測定結(jié)果表明,CCH造模后24 h,腦灌注水平比假手術(shù)組降低了54.9%,表明采用微彈簧致雙側(cè)頸總動脈狹窄,可成功復制全腦低灌注模型。

圖1 甲苯胺藍O染色表示CCH模型小鼠腦組織灌流改變

為驗證模型組小鼠是否產(chǎn)生認知功能障礙,利用Morris水迷宮實驗檢測小鼠的認知情況。小鼠定位航行過程逃避潛伏期的變化(圖2(a))結(jié)果說明,隨著訓練天數(shù)增長,模型組小鼠未對水迷宮內(nèi)標注物有所識別,未表現(xiàn)出學習功能,至訓練第五天時,逃避潛伏期為73±47 s,與對照組(26±21 s)比較其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。原平臺位置的穿越次數(shù)(圖2(b))、目標象限(原平臺所在象限)的路程比(圖2(c))以及時間比(圖2d)三項指標,與對照組比較其差異均具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以上結(jié)果說明,該慢性全腦低灌注方法可導致小鼠認知功能障礙。

圖2 Morris水迷宮測定全腦低灌注致小鼠認知功能變化

3.2 毛蕊花苷改善慢性全腦低灌注所致小鼠認知障礙

為確定毛蕊花苷對小鼠認知障礙的影響,利用Morris水迷宮實驗檢測小鼠的認知功能。小鼠定位航行過程逃避潛伏期(圖3(a))的結(jié)果說明,受毛蕊花苷干預的CCH小鼠對水迷宮內(nèi)部標志物表現(xiàn)出良好的學習記憶能力,隨著訓練的進行可更快地尋找到救援平臺。毛蕊花苷各劑量組均能顯著縮短其逃避潛伏期時間(P<0.01),至訓練第五天時,低中高劑量逃避潛伏期分別為50±21 s,44±16 s, 40±27 s,與模型組(83±37s)比較組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。撤去平臺后,穿越平臺次數(shù)結(jié)果(圖3(b))表明,中高劑量組與模型組相比組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),低劑量組沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。目標象限路程百分比(圖3(c))和時間百分比(圖3(d))兩項指標均表明,各劑量組與模型組相比,組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比,高劑量毛蕊花苷組可將路程比和時間比分別提高8.6%、8.3%。

3.3 毛蕊花苷下調(diào)慢性全腦低灌注所致小鼠腦乙酰膽堿酯酶活力升高

為進一步探究毛蕊花苷如何改善CCH模型小鼠認知功能障礙,通過檢測小鼠腦部海馬區(qū)AChE活力(圖4),反映小鼠腦部神經(jīng)沖動傳導情況。CCH模型小鼠建成之后,與對照組相比小鼠腦部海馬區(qū)AChE活力顯著升高(P<0.01)。單因素方差分析的結(jié)果表明:毛蕊花苷各劑量組均能顯著降低CCH小鼠AChE活力(P<0.01)，與模型組相比,高劑量毛蕊花苷組可降低 0.26 U/mg。

3.4 毛蕊花苷改善慢性全腦低灌注所致小鼠腦部氧化應激損傷

為探究毛蕊花苷能否改善小鼠腦部氧化應激損傷,對小鼠腦部海馬區(qū)SOD活力、MDA的含量進行檢測,結(jié)果分別如圖5、圖6所示。與假手術(shù)組相比,CCH模型小鼠腦部海馬區(qū)的SOD活力明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01)。單因素方差分析的結(jié)果表明:毛蕊花苷中高劑量可顯著升高SOD活力(P<0.01),但是低劑量組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。毛蕊花苷各劑量組均能顯著降低MDA含量(P<0.01),高劑量毛蕊花苷組可使MDA 含量降低至模型組的82.5%。

圖3 毛蕊花苷對全腦低灌注致小鼠認知功能損害的影響

圖4 毛蕊花苷對慢性全腦低灌注小鼠海馬區(qū)AChE活力的影響

圖5 毛蕊花苷影響慢性全腦低灌注小鼠海馬區(qū)SOD活力情況

圖6 毛蕊花苷影響慢性全腦低灌注小鼠海馬區(qū)MDA含量

4 討 論

肉蓯蓉具有補腎陽,益精血,潤腸通便之功效,已有蓯蓉總苷膠囊用于血管性癡呆臨床干預[12],但該制劑中主要含有松果菊苷和異毛蕊花糖苷,毛蕊花苷含量較低[13],尚不足以支持毛蕊花苷對血管性癡呆有明確干預作用。有研究表明毛蕊花苷對缺血性腦損傷有神經(jīng)保護作用[14],但缺乏其對腦低灌注致認知功能障礙的確切作用證據(jù)。本研究于飲水中補充較低質(zhì)量濃度(0.16～0.64 g/L)毛蕊花苷，明顯改善了小鼠認知功能障礙。有研究表明毛蕊花苷具有良好的水溶性及穩(wěn)定性[15],其來源植物肉蓯蓉已為藥食同源植物。本研究提示或可以毛蕊花苷作為關(guān)鍵指標成分,開發(fā)基于肉蓯蓉的功能飲品,以改善老年人因腦供血不足而引發(fā)輕度認知功能障礙。

乙酰膽堿(ACh)是腦部神經(jīng)沖動傳導所必需的神經(jīng)遞質(zhì),AChE活力值升高必定會引發(fā)ACh的過度水解,引發(fā)腦部神經(jīng)傳導紊亂,參與諸多類型癡呆的發(fā)生[16]。本研究表明毛蕊花苷下調(diào)CCH模型小鼠海馬組織AChE活性,或可改善腦內(nèi)ACh水平,改善認知功能障礙,但仍待進一步研究確證。慢性腦低灌注致神經(jīng)元損傷以及中樞膽堿功能障礙與慢性炎癥及氧化應激損傷相關(guān)[17],此時過量生成活性氧可直接損傷各類生物大分子及不飽合脂肪酸,活性氧可滅活抗氧化酶進一步加劇氧化應激損傷,這一失代償過程引發(fā)活性氧大量積累并誘導神經(jīng)元凋亡,并致認知功能障礙發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)CCH小鼠晚期海馬組織SOD活性明顯下降,MDA水平明顯升高,提示海馬組織抗氧化酶已處于失代償?shù)膰乐匮趸瘧顟B(tài)。給予毛蕊花苷后,CCH小鼠海馬組織SOD活力明顯升高,MDA水平明顯下降,表明毛蕊花苷一定程度上通過抗氧化作用發(fā)揮改善CCH小鼠認知功能障礙的作用。

5 結(jié) 論

本研究復制了CCH小鼠認知功能損害模型，于飲水中補充肉蓯蓉毛蕊花苷提取物,明顯改善CCH小鼠認知功能下降及腦組織氧化應激狀態(tài),提示肉蓯蓉毛蕊花苷部位對改善慢性腦低灌注致神經(jīng)損傷有一定保護作用。