薛亞明，于躍海，晉學(xué)飛，晉凡永

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 泌尿外科，吉林 長春130033)

膀胱尿路上皮癌(UCB)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約有60%-75%的初診UCB為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)[1]。對于這部分患者，通常應(yīng)用經(jīng)尿道膀胱電切術(shù)(TUR-B)序貫絲裂霉素C或卡介苗(BCG)膀胱灌注治療[2]。雖然膀胱得以保留，但復(fù)發(fā)率較高，治療后若復(fù)查不及時，可能復(fù)發(fā)并發(fā)展為肌肉浸潤性膀胱癌[3]。篩選新的分子標(biāo)志物，區(qū)分不同復(fù)發(fā)風(fēng)險的T1期NMIBC患者是目前研究的熱點。

成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)是UCB中最常見的發(fā)生過表達(dá)和突變的基因，約有40%的UCB患者攜帶FGFR3突變，其中近80%為低級別UCB[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，UCB早期即發(fā)生FGFR3突變，而FGFR3的過表達(dá)與其突變率增加有關(guān)[5]。細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑2A(CDKN2A)是抑癌蛋白P16的編碼基因，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)9號染色體9p區(qū)域發(fā)生雜合性缺失會造成CDKN2A表達(dá)缺失，Ploussard 等研究發(fā)現(xiàn)CDKN2A與FGFR3之間可能存在相互作用[6]。本研究目的在于觀察FGFR3和CDKN2A在T1期NMIBC的表達(dá)情況，并分析其對預(yù)后的預(yù)測價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2014年至2016年，在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院泌尿外科行TUR-B治療的NMIBC患者的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)腫瘤樣本，并收集對應(yīng)的臨床和病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均為初診；(2)T1期NMIBC；(3)所有患者在初次TUR-B治療后6-8周，再次行TUR-B治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)TUR-B治療前接受過中醫(yī)藥治療；(2)FFPE標(biāo)本切片少于50%腫瘤細(xì)胞；(3)失訪患者。病理分期和分級由兩名正高級病理醫(yī)師相互獨立評價，評價依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)2010年發(fā)布的第七版TNM分期和世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年發(fā)布的膀胱腫瘤分類。腫瘤無復(fù)發(fā)生存(RFS)定義為以病理學(xué)為診斷依據(jù)，未發(fā)生UBC(包括NMIBC和MIBC)；腫瘤無進(jìn)展生存(PFS)定義為未發(fā)生MIBC或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；腫瘤特異性生存(CSS)定義為因腫瘤原因死亡；總生存(OS)定義為因任何原因發(fā)生死亡。所有臨床終點均以截至隨訪完成時。

1.2 mRNA表達(dá)的檢測本次研究應(yīng)用RT-qPCR方法檢測mRNA的表達(dá)。應(yīng)用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit試劑盒(Catlog：80004，Qiagen，German)對FFPE標(biāo)本進(jìn)行RNA提取。所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。提取RNA后，用Nanodrop 2000進(jìn)行定量并評價提取質(zhì)量。應(yīng)用TransScript○RGreen One-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒(Catlog：AQ211-01，Transgen，China)對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行RT-qPCR。本次研究除了檢測FGFR3和CDKN2A mRNA表達(dá)水平之外，還檢測基底亞型和管狀亞型的標(biāo)志物KRT5和KRT20，內(nèi)參選用Calmodulin-2(CALM2)。各基因PCR引物序列如下：FGFR3，正義鏈：5’-CGTACTGTGCCACTTCAGTG-3’，反義鏈：5’-CCAGCAGCTTCTTGTCCATC-3’；CDKN2A，正義鏈：5’-GAGGGCTTCCTAGACACTCTG- 3’，反義鏈：5’-CGCAAATACCGCA-CGAC- 3’；KRT5：正義鏈：5’- CGGTAGTGGATTTGGTTTCG-3’，反義鏈：5’-TGGTGTTGCGGAGGTCAT-3’；KRT20：正義鏈：5’-GCAGTGGTACGAAACCAACG-3’，反義鏈：5’-CTGCAGCCAGCTTAGCATTG-3’；CALM-2：正義鏈：5’- CCACCATGGCTGATCAACTG-3’，反義鏈：5’-GCCATTGCCATCAGCGTCTA-3’。基因相對定量采用2-△△Ct法計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用Spearman相關(guān)性檢驗分析各基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性；應(yīng)用受試者工作曲線(ROC)中約登指數(shù)(Youden’s index)確定每個標(biāo)志物的最佳分界值(Cut-off value)；應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析曲線進(jìn)行預(yù)后分析；應(yīng)用Cox多因素回歸風(fēng)險模型分析臨床、病理因素與預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用SPSS 25.0對結(jié)果進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隊列信息根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，本次研究共納入62例患者，其中男性42例，女性20例，中位年齡68歲，中位隨訪時間64個月，其中低級別1例(1.61%)，高級別61例(98.39%)，存在淋巴管侵犯1例(1.61%)，無淋巴管侵犯61例(98.39%)，原位癌(CIS)21例(33.87%)，序貫卡介苗膀胱灌注27例(43.55%)，序貫絲裂霉素C膀胱灌注11例(17.74%)。

2.2 FGFR3和CDKN2A mRNA表達(dá)與臨床、病理參數(shù)的相關(guān)性Spearman非參數(shù)秩和檢驗結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR3與CDKN2A mRNA的表達(dá)無相關(guān)，與KRT5(rs=0.297，P=0.005)和KRT20 mRNA的表達(dá)均呈正相關(guān)(rs=0.314，P<0.001)；FGFR3高表達(dá)與腫瘤分級呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.37，P<0.001)。CDKN2A與KRT5 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.331，P=0.021)，而與KRT20 mRNA的表達(dá)無相關(guān)性。FGFR3和CDKN2A mRNA的表達(dá)與年齡、性別和序貫膀胱灌注治療無相關(guān)性。

2.3 FGFR3和CDKN2A mRNA表達(dá)與臨床結(jié)局的關(guān)系應(yīng)用ROC曲線，通過約登指數(shù)確定對于不同的臨床結(jié)局患者FGFR3和CDKN2A的最佳臨界值，并據(jù)此將患者分為FGFR3(或CDKN2A)mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組。應(yīng)用Kaplan-Meier分析兩組患者不同臨床結(jié)局的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3 mRNA高表達(dá)組的患者具有更差的RFS，但PFS和OS有所提高，F(xiàn)GFR3 mRNA的表達(dá)與CSS無關(guān)，CDKN2A mRNA高表達(dá)組的患者具有更差的OS，而與RFS、PFS和CSS無關(guān)。見表1、表2。

表1 FGFR3表達(dá)情況與臨床結(jié)局的關(guān)系

表2 CDKN2A表達(dá)情況與臨床結(jié)局的關(guān)系

2.4 影響T1期NMIBC患者RFS和OS的單因素和多因素分析在單因素Cox回歸分析中，高齡(≥70歲)、FGFR3高表達(dá)和CDKN2A高表達(dá)與復(fù)發(fā)風(fēng)險增加顯著相關(guān)；將這三個因素納入多因素Cox回歸分析中，高齡(≥70歲)和FGFR3高表達(dá)與復(fù)發(fā)風(fēng)險增加顯著相關(guān)。見表3。在單因素Cox回歸分析中，F(xiàn)GFR3高表達(dá)與降低OS顯著相關(guān)，鑒于FGFR3表達(dá)是OS唯一重要的預(yù)后標(biāo)志物，因此沒有對FGFR3進(jìn)行多變量分析。見表4。

表3 影響T1期NMIBC患者RFS的單因素及多因素Cox回歸分析

表4 影響T1期NMIBC患者OS的單因素Cox回歸分析

3 討論

FGFR3狀態(tài)異常(過表達(dá)或突變)是UCB發(fā)生、發(fā)展的主要分子因素之一。目前研究結(jié)果認(rèn)為，F(xiàn)GFR3狀態(tài)異常可能是UCB早期的分子事件，且與UCB的分級和預(yù)后有關(guān)，但FGFR3與生存率的關(guān)系并不一致。van Rhijn等人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3突變的UCB患者RFS和CSS更長[7]，而Hernández等人則發(fā)現(xiàn)FGFR3突變可能會增加TaG1期UCB患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率[4]。也有研究認(rèn)為FGFR3與UCB預(yù)后無關(guān)[8]。Burger等人分析了221例NMIBC患者FGFR3的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)存在FGFR3突變的患者，PFS更長，這一點在T1期高級別NMIBC患者中更為顯著[9]。Sikic也得到了類似的研究結(jié)果，且對這部分患者進(jìn)行了分層分析，發(fā)現(xiàn)這僅在年輕(<70歲)患者身上呈現(xiàn)相關(guān)性[10]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3 mRNA高表達(dá)組的患者復(fù)發(fā)率更高，但PFS和OS有所提高。目前有幾項研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FGFR3發(fā)生突變后，9號染色體9p區(qū)域會發(fā)生雜合子缺失，這會影響CDKN2A基因，并導(dǎo)致抑癌蛋白P16的表達(dá)降低，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[11]。Ploussard等人分析了58例NMIBC患者CDKN2A和FGFR3的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)9號染色體存在雜合性的患者中，F(xiàn)GFR3是否突變與預(yù)后無關(guān)，而對于9號染色體雜合性缺失的患者，F(xiàn)GFR3野生型的患者，其復(fù)發(fā)和疾病進(jìn)展的風(fēng)險會顯著高于FGFR3突變型的患者[6]。Rebouissou等人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FGFR3發(fā)生突變時，CDKN2A純合子缺失的發(fā)生頻率更高[11]。

CDKN2A的表達(dá)降低可能與UBC患者的不良預(yù)后有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2A mRNA高表達(dá)組的患者具有更差的OS，與目前大部分研究結(jié)果相似。Breyer等人研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CDKN2A高表達(dá)的同時，F(xiàn)GFR3表達(dá)降低，這部分患者的PFS最差，對于T1期NMIBC患者，CDKN2A高表達(dá)仍是預(yù)后較差的預(yù)測因素之一[12]。CDKN2A作為一種抑癌基因，目前部分研究呈現(xiàn)出與其功能截然相反的結(jié)果，對于CDKN2A mRNA過表達(dá)為何會導(dǎo)致預(yù)后較差，目前尚不清楚。Lukas等研究認(rèn)為，CDKN2A發(fā)生點突變對于UCB的發(fā)生、發(fā)展過程意義不大，但CDKN2A可以在抑癌因子RB1的上游發(fā)揮作用，其表達(dá)與TP53的表達(dá)有關(guān)，當(dāng)RB1或TP53發(fā)生突變時，可能會減弱CDKN2A的抑癌作用[13]。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，約有50%的NMIBC患者存在TP53突變，13%的患者存在RB1突變，而Meeks等人的隊列中，這兩個基因的突變頻率更高[14]。Al-Khalaf等人研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2A可以上調(diào)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)、細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)和E2F1轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)等。通過這種方式間接介導(dǎo)p16的表達(dá)[15]。然而，CDKN2A和FGFR3之間尚未顯示出直接關(guān)系，這需要進(jìn)一步研究。

本研究存在一定的局限性，首先是回顧性分析，且隊列中患者數(shù)量較少，這限制了該研究的可重復(fù)性。其次，沒有分析FGFR3和CDKN2A的聯(lián)合表達(dá)，并進(jìn)行分層分析，因為隊列患者數(shù)量較少，包括組織學(xué)分級為低級別和存在淋巴管侵犯都僅有1例患者，進(jìn)行更為細(xì)致的亞組分析可能得不到任何有意義的結(jié)論。此外，僅分析了FGFR3和CDKN2A的mRNA的表達(dá)情況，未應(yīng)用免疫組化方法檢測急性蛋白水平的觀察，且未分析其突變狀態(tài)，這些都需要后續(xù)改進(jìn)。

綜上，對于T1期NMIBC患者，F(xiàn)GFR3 mRNA高表達(dá)可能預(yù)示著較差的RFS，但OS更好。