張 明，黃旋妹，劉和錄

(深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 深圳518104)

宮頸癌是嚴重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤，在女性常見癌癥中排第4位[1]。全球每年約有53萬宮頸癌新增病例，死亡人數(shù)超過27萬，其中有85%發(fā)生在衛(wèi)生資源欠缺的發(fā)展中國家，2018年我國約有10.6萬例女性被診斷為宮頸癌，死亡病例高達4.8萬例，新增病例和死亡病例逐年上升，宮頸癌已嚴重危害女性的健康[1-2]。正常宮頸上皮細胞通過宮頸上皮內(nèi)病變逐步發(fā)展為宮頸癌，其中高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)感染是引起宮頸癌的必要條件[3]，如果能通過早期篩查和診斷，在癌前病變階段進行治療，有98%的病例是可以治愈，而一旦疾病發(fā)展為癌并擴展至其他器官，女性的5年生存率不超過17%[4]。由于HR-HPV檢查和細胞學檢查對宮頸癌前病變陽性預(yù)測值低至44%，且HR-HPV檢查特異度不高[5]，往往給患者帶來心理恐懼或過度檢查。從過往的研究看，HPV陽性宮頸癌病例的發(fā)生與HPV基因組整合到宿主基因組有關(guān)[6]，E6和E7基因DNA的整合和蛋白的失調(diào)表達是HR-HPV病毒導(dǎo)致宮頸病變的重要原因[7-9]。先前的研究表明，HPV DNA檢查相比于HPV mRNA檢查特異性較低，而細胞學檢查也存在一定的滯后性和漏診率[10-11]，因此，檢測作為癌基因表達指標的HPV E6/E7 mRNA 用于早期篩查和診斷宮頸癌在理論上優(yōu)于直接檢測HPV DNA和細胞學檢查。

目前，檢測HPV E6/E7 mRNA 的方法有多種，包括原位雜交、熒光定量PCR等方法，原位雜交技術(shù)無法自動化和高通量檢測，且需要人工判讀結(jié)果，易受主觀因素影響，qPCR需要提取mRNA模板和指數(shù)級放大檢測信號，其穩(wěn)定性差且易污染造成假陽性結(jié)果。有學者采用流式細胞術(shù)檢測宮頸脫落細胞HPV E6/E7 mRNA 取得成功并克服了傳統(tǒng)方法的不足[12]。因此，本研究通過流式細胞術(shù)研究HPV E6/E7 mRNA和宮頸病變的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)性，為宮頸癌的早期篩查和診斷提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2018年至2019年深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院宮頸上皮瘤變CIN Ⅱ 11例，CIN Ⅲ 15例，宮頸癌樣本18例以及正常對照樣本16例。該研究中所有樣品均獲患者知情同意和深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1HPV E6/E7 mRNA表達水平的檢測 (1)樣本黏液液化及樣本的制備：采用含有消化黏蛋白和RNA酶抑制劑的保存液，在10 min內(nèi)液化樣本使宮頸脫落細胞重懸并防止其降解。(2)細胞固定：采用細胞固定液，使其在30 min內(nèi)迅速完成固定過程，且達到檢測要求的固定效果。(3)細胞通透：在常規(guī)皂素通透劑的基礎(chǔ)上進行工藝和配方優(yōu)化，選擇合適的濃度及通透緩沖液，使熒光標記的分子信標自由出入于固定好的細胞。(4) 檢測探針設(shè)計及熒光標記技術(shù)：通過文獻查閱、基因轉(zhuǎn)錄文庫的序列分析、分子信標的雜交性能評價等過程后，選擇評分高的3組序列，外送專業(yè)公司進行序列合成及熒光素標記。最后通過流式細胞檢測進行效果評價后確定。(5) 流式細胞儀檢測熒光信號：正確調(diào)整閾值排除碎片干擾，正確進行顏色補償，以校正熒光染料光譜之間疊加所造成的誤差。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA 陽性率的判斷 (1)每個樣品脫落細胞數(shù)量大于1000個為合格樣品;(2)陽性樣本的判斷原則：每個樣本中陽性細胞占該樣品中所有細胞的比例大于2%即判定為陽性樣本。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad prism 5軟件進行數(shù)據(jù)處理。各項數(shù)據(jù)采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行分析。P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV E6/E7 在宮頸癌病變中的表達

通過流式細胞術(shù)檢測正常對照樣本和宮頸不同程度病變樣本中HPV E6/E7 mRNA水平的變化，結(jié)果顯示HPV E6/E7 mRNA 的表達在正常對照組和宮頸病變樣品中具有顯著差異，這表明HPV E6/E7具有作為宮頸病變預(yù)測和診斷的分子標志物的潛力,見圖1。

圖1 HPV E6/E7 mRNA在正常對照和宮頸病變樣本中的表達情況

為了進一步了解HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變不同組中的表達情況，對不同樣本中的HPV E6/E7 mRNA的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明HPV E6/E7 mRNA在正常組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組的陽性表達率分別為18.8%、72.7%、80%及88.9%(χ2=21.33，P<0.0001)。HPV E6/E7 mRNA的表達情況：CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組都高于正常組(P<0.05);CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組三組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組HPV E6/E7 mRNA的表達比較

2.2 ROC曲線評估HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變中的診斷價值

為了分析HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變中的診斷價值，將各組別的陽性率進行ROC曲線分析，隨后使用ROC曲線下的相關(guān)區(qū)域面積(AUC)來評估其診斷潛力，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA具有顯著區(qū)分正常和宮頸病變的潛力，其AUC達0.8778(95% CI 0.7932-0.9624,P<0.0001)。見圖2。

圖2 HPV E6/E7 mRNA的ROC曲線

進一步評估HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變診斷中的靈敏度和特異度，HPV E6/E7 mRNA檢測診斷高級別宮頸病變的靈敏度為81.82%(95% CI 67.29%-91.81%)，特異度為81.25%(95% CI 54.35%-95.95%)，陽性預(yù)測值為92.31%(95% CI 79.13%-98.38%)，陰性預(yù)測值為61.90%(95% CI 38.44%-81.89%)。見表2、表3。

表2 HPV E6/E7 mRNA檢測與病理檢查結(jié)果

表3 HPV E6/E7 mRNA 檢測對宮頸病變的診斷價值(%)

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，大量的流行病學調(diào)查和研究表明HPV的持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的首要原因[13]。HPV16和HPV18是最具侵略性的病毒類型[14]，全球絕大部分的宮頸癌的發(fā)生與其有關(guān)，它們通過持續(xù)感染并整合到宿主基因組中，一方面導(dǎo)致各種腫瘤抑制因子的沉默，另一方面誘導(dǎo)各種腫瘤促進因子的激活，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[2]。HPV 基因組的癌基因E6和E7是正常宮頸上皮中腫瘤發(fā)生的主要驅(qū)動器，它們通過將其DNA整合到宿主染色體脆弱區(qū)，使E6和E7蛋白過量表達，這兩種蛋白通過抑制p53、Rb等抑癌基因的功能參與Notch1、Wnt、MAPK、mTOR以及 STAT等相關(guān)通路的調(diào)控，從而影響細胞的生長、分化及免疫功能，最終導(dǎo)致細胞生長失控并永生化為癌細胞[3,15-18]。由于細胞學形態(tài)變化是HPV感染宮頸上皮細胞后引起的，因此細胞學檢查在早期篩查中存在一定的弊端，且常受實驗操作和取材的影響。HPV的早期篩查聯(lián)合細胞學檢查能有效的避免單項檢查的不足，提高早期篩查的效率。

本研究利用流式細胞術(shù)定量檢測了對照樣本和不同程度的宮頸病變樣本中HPV E6/E7 mRNA的表達情況以評估HPV E6/E7 mRNA作為早期篩查指標的診斷效能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIN Ⅱ組(72.7%)、CIN Ⅲ組(80%)和宮頸癌組(88.9%)的HPV E6/E7 mRNA陽性率顯著高于正常對照組(18.8%)，差異具有統(tǒng)計學意義，表明HPV E6/E7 mRNA 作為篩查指標的可行性，但在我們的研究中宮頸病變各組之間HPV E6/E7 mRNA的表達水平?jīng)]有顯著差異，這也與其他學者的報道較一致[19]。根據(jù)宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA的表達量進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示ROC曲線下的相關(guān)區(qū)域面積AUC達0.8778(95% CI 0.7932-0.9624)，差異具有統(tǒng)計學意義，這表明了HPV E6/E7 mRNA作為宮頸癌篩查指標的重要價值，同時我們進一步對比了其他研究的報道，我們發(fā)現(xiàn)流式細胞術(shù)檢測的HPV E6/E7 mRNA的診斷效能顯著高于HPV DNA的檢測，這與其他學者的報道一致[20-21]，且優(yōu)于其他方法對HPV E6/E7 mRNA的檢測[19]。因為CINⅡ-Ⅲ 屬于高級別的宮頸上皮內(nèi)病變，常常需要有創(chuàng)操作進行干預(yù)，因此在該研究中我們對CINⅡ級及以上的病變進行深入的分析。本研究發(fā)現(xiàn)CINⅡ+ HPV E6/E7 mRNA的靈敏度為81.82%，特異度為81.25%，陽性預(yù)測值為92.31%，此結(jié)果與學者Kottaridi的研究較一致[12]，可見HPV E6/E7 mRNA可以準確地篩選出宮頸病變高危人群并監(jiān)測疾病的發(fā)展。但該研究中陰性預(yù)測值僅為61.90%，其準確性欠佳，因此HPV E6/E7 mRNA作為宮頸癌早期篩查還需要與細胞學檢查等手段聯(lián)合分析才能避免漏診，從而更好的為臨床服務(wù)。

目前，市面上常見的檢測核酸產(chǎn)品技術(shù)主要包括熒光定量PCR技術(shù)、核酸原位雜交技術(shù)、基因測序技術(shù)等。由于這些技術(shù)尚存在難以自動化、分析過程復(fù)雜、價格昂貴等特點因此較難普及。本技術(shù)的試驗操作基本上同傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)相同，處理96樣本的全程操作到獲得檢測數(shù)據(jù)僅需2小時時間，節(jié)省了至少一倍的時間，全程不需核酸提取和擴增反應(yīng);在細胞內(nèi)直接進行分子信標雜交后上機進行檢測，具有穩(wěn)定性高、特異性強、靈敏度高、更快速和結(jié)果客觀的技術(shù)優(yōu)勢;儀器及試劑價格與熒光PCR比較類似，相信具有較為廣闊的應(yīng)用前景。