祁夢(mèng)凡，謝 蘇，高若男，孫義姍，孫曉梅，和軍飛,2，魯慧文,2，盧世豪，陳 鑫，李清春，黃 濤,2*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，昌吉 831100)

在胚胎附植和早期妊娠的相關(guān)研究中，由于其涉及的基因、通路和生理過程極其復(fù)雜，導(dǎo)致對(duì)胚胎附植機(jī)制進(jìn)行解析十分困難。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)翻譯的最終產(chǎn)物，直接反映了生物體生命的復(fù)雜性和多樣性。蛋白質(zhì)組學(xué)可以對(duì)某一時(shí)期存在于某一細(xì)胞、組織或器官中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)鑒定和研究。Choe等[1]對(duì)患有子宮內(nèi)膜炎牛的子宮內(nèi)膜與正常牛的子宮內(nèi)膜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)desmin和α-actin-2可能在子宮內(nèi)膜炎的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。Mullen等[2]對(duì)胚胎附植前高產(chǎn)奶牛的子宮內(nèi)環(huán)境進(jìn)行蛋白組研究，總共發(fā)現(xiàn)34種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，推測(cè)其可能參與了為胚胎附植做準(zhǔn)備的子宮環(huán)境重構(gòu)、胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和保護(hù)、保持子宮健康、以及母體免疫調(diào)節(jié)。Koch等[3]鑒定了未妊娠和早期妊娠綿羊子宮液中的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)有15種與胚胎發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)蛋白(最高有65倍)，數(shù)據(jù)提供了子宮與孕體水平上與妊娠早期相關(guān)聯(lián)的動(dòng)態(tài)生理過程。通過對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定來研究基因的表達(dá)或?qū)⒊蔀樨i胚胎附植機(jī)理研究的一個(gè)新思路。

在動(dòng)物妊娠早期胚胎發(fā)育過程中存在的極為復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[4]中有一些信號(hào)分子可以作為妊娠早期分子標(biāo)志物。1974年在孕鼠血清中發(fā)現(xiàn)了早孕因子[5]。早孕因子是最早確認(rèn)妊娠的生物化學(xué)標(biāo)志物之一，反映胚胎成活能力[6]。HCG是一種糖蛋白激素，受精卵的滋養(yǎng)層細(xì)胞在受精后第6天形成,之后就開始分泌微量的HCG，受精后第10天可從母體血清中檢測(cè)到，HCG可作為確認(rèn)妊娠的生物化學(xué)標(biāo)志物[7]，并在人的早期妊娠診斷中得到廣泛應(yīng)用。薄小輝[8]在奶牛胎兒胎盤中分離鑒定出8種PAGs天然蛋白，并用表達(dá)的PAG4重組多肽免疫兔獲得多克隆抗體，可用于區(qū)分妊娠奶牛和未妊娠奶牛血清。研究表明，相對(duì)于第0天，奶牛人工授精21 d后RSAD2基因的表達(dá)量顯著升高[9]。蛋白質(zhì)在表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮十分重要的作用，它們?cè)趧?dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育不同的生理階段都具有重要的調(diào)控作用。iTRAQ技術(shù)作為新興的蛋白質(zhì)組學(xué)定量手段，具有重復(fù)性好、通量高等優(yōu)勢(shì)，可為蛋白質(zhì)定量以及尋找相關(guān)生物標(biāo)志物等方面提供可靠依據(jù)[10-12]，多被應(yīng)用于腫瘤生物標(biāo)志物的篩選[13-14]。通過篩選差異蛋白質(zhì)來尋找生物標(biāo)志物的方法已經(jīng)成為一個(gè)主流[15]，但妊娠早期母豬外周血中蛋白標(biāo)志物的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

本研究篩選在妊娠早期差異表達(dá)的蛋白，驗(yàn)證了其表達(dá)情況，旨在揭示母豬配種后第15天(即胚胎附植期)外周血中蛋白的表達(dá)差異，為尋找潛在的母豬早期妊娠生物標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 測(cè)試組 選取8頭健康、生產(chǎn)表現(xiàn)正常且體況相近的長(zhǎng)大二元經(jīng)產(chǎn)母豬作為iTRAQ分析樣本，隨機(jī)分為2組，即試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組4頭。按照常規(guī)生產(chǎn)流程查情配種，試驗(yàn)組母豬輸入正常的精液，對(duì)照組母豬輸入死精(正常精液高溫煮沸，并在顯微鏡下觀察確認(rèn)精子死亡)。在配種后第15天采集試驗(yàn)組、對(duì)照組母豬血液，分離血漿，立即置于干冰中冷凍保存，并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 驗(yàn)證組 另于大群中隨機(jī)采集配種后第15天母豬血液樣本30例作為ROC曲線分析樣本，分離血漿，立即置于干冰中冷凍保存，并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室并置于超低溫冰箱保存。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

主要儀器包括超低溫冰箱(-80 ℃)、恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、單道移液器、多道可調(diào)移液器、梯度PCR儀、超凈工作臺(tái)、NanoDrop 2000(Thermo Scientific，美國(guó))、LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、八連排離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水平電泳槽電泳儀、GelDoc X R型凝膠成像系統(tǒng)及酶標(biāo)儀(Thermo)等。

1.3 主要試驗(yàn)試劑

主要試劑包括反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer ScriptTMRT regagent Kit(TaKaRa)、血漿總RNA提取試劑盒(RP4001，百泰克)、Light Cycler 480 SYBR GreenⅠ(Roche)、八連管(Roche)；RNA線性酶(RNR-07250, Epicentre)；DNA MarkerⅠ(天根)、Agarose瓊脂糖(Invitrogen)、ProteoPrep?Blue白蛋白及IgG去除試劑盒(Sigma-Aldrich)、Bradford 蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(碧云天)、端粒重復(fù)結(jié)合因子2(TERF2)、結(jié)合珠蛋白(HP)、脂聯(lián)素(ADIPOQ)和細(xì)絲蛋白C(FLNC)的ELISA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)等。

1.4 蛋白樣品制備及質(zhì)檢

從超低溫冰箱(-80 ℃)取出血漿樣品，分別加入4倍體積的裂解緩沖液，進(jìn)行超聲裂解。然后4 ℃，12 000 g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，利用Bradford 蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。使用ProteoPrep?Blue白蛋白及IgG去除試劑盒(Sigma-Aldrich)去除高峰度蛋白。SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白樣品質(zhì)量，以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 iTRAQ定量分析

1.5.1 胰蛋白酶酶切、標(biāo)記、分餾及LC-MS/MS分析 樣品各取100 μg 蛋白加入10 mmol·L-1DTT在37 ℃還原60 min，25 mmol·L-1碘乙酰胺(IAM)暗處室溫反應(yīng)30 min。使用胰蛋白酶進(jìn)行二步法酶切，胰酶酶解完成后進(jìn)行strata x spe 柱子脫鹽，真空干燥。肽段使用8-plex iTRAQ試劑標(biāo)記。HPLC溶液A溶解干燥的標(biāo)記后肽段，進(jìn)行HPLC分餾，收集餾分48管，合成15管。將分餾樣品溶解在溶液 A 中，按表1洗脫梯度進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。全掃描分辨率為70 000。離子強(qiáng)度前15位的母離子進(jìn)行碎裂能為32%的HCD碎裂，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為10 s。

表1 洗脫梯度參數(shù)

1.5.2 iTRAQ數(shù)據(jù)分析 通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)下載豬蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)(物種編號(hào)：9823，包含40706蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)組編號(hào)：UP000008227)，使用軟件Proteome Discoverer(版本1.3，Thermo Scientific)進(jìn)行搜庫(kù)。設(shè)置胰蛋白酶為消化酶，允許2個(gè)漏切位點(diǎn)。半胱氨酸碘乙酰化，iTRAQ(肽段N-末端，賴氨酸，酪氨酸)為固定修飾，甲硫氨酸氧化和氨基端乙?；癁榭勺冃揎?。搜索設(shè)置肽段容差20 ppm，產(chǎn)生的子離子容為0.05 Da，容錯(cuò)率(FDR)為1%。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用t檢驗(yàn)分析兩組樣本間蛋白表達(dá)的差異，篩選條件為顯著性檢驗(yàn)值P<0.05和兩組樣本定量比值FC>1.20或FC<0.83。通過對(duì)獲得的差異蛋白GO分析，進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的分類注釋。使用KEGG的在線工具KEGG mapper繪制注釋蛋白的代謝通路。利用P值進(jìn)行蛋白質(zhì)功能富集，使用R語言中的pheatmap包進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的聚類分析。差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析使用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)在線軟件進(jìn)行。

1.7 ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定驗(yàn)證

參照ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2蛋白的表達(dá)量。使用SPSS 21.0軟件分析妊娠與非妊娠組中差異表達(dá)蛋白表達(dá)量。數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，使用t檢驗(yàn)測(cè)試樣品之間的差異。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

1.8 受試者工作特征曲線(ROC)分析

作為ROC曲線分析的配種后15 d母豬外周血液樣本采集后，分別在配種后第25 和第35 天對(duì)所有配種母豬進(jìn)行B超檢驗(yàn)，以確定是否妊娠。參照ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)配種后15 d母豬外周血液中FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2蛋白的表達(dá)量，并進(jìn)行受試者工作特征曲線(ROC)分析。

2 結(jié) 果

2.1 去高豐度蛋白及 SDS-PAGE電泳

經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，凝膠圖結(jié)果顯示(圖1)，從血漿中獲得了含量相對(duì)豐富的蛋白質(zhì)，條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，相對(duì)于血漿原液，蛋白樣品已去除大量高峰度蛋白且無降解，滿足后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)要求?？偟鞍子肂radford蛋白濃度測(cè)定試劑盒分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)濃度均超過7.0 μg·μL-1，能夠滿足后續(xù)上機(jī)的iTRAQ試驗(yàn)要求。

A01、A03、A06、A12為妊娠第15天血液蛋白樣本；A02、A04、A09、A10為非妊娠第15天血液蛋白樣本

2.2 差異表達(dá)蛋白篩選

利用t檢驗(yàn)分析兩組樣本間蛋白表達(dá)的差異，篩選條件為顯著性檢驗(yàn)值P<0.05和兩組樣本定量比值FC>1.20或FC<0.83。共檢測(cè)到917個(gè)蛋白，差異表達(dá)蛋白24個(gè)，圖2為差異蛋白聚類圖。妊娠與非妊娠相比，上調(diào)蛋白19個(gè)，下調(diào)蛋白5個(gè)(圖3)。與非妊娠組相比，妊娠組中有許多蛋白表達(dá)上調(diào)，包括雌激素受體2(ESR2)、肌動(dòng)蛋白(MSC)、端粒重復(fù)結(jié)合因子2(TERF2)、結(jié)合珠蛋白(HP)、纖溶酶原(PLG)、脂聯(lián)素(ADIPOQ)，以及下調(diào)的絲氨酸/蘇氨酸激酶31(STK31)。表2列出了全部24個(gè)差異表達(dá)蛋白。

表2 妊娠與非妊娠組中24個(gè)差異表達(dá)蛋白

列代表不同樣品，行代表不同的蛋白質(zhì)ID，以表達(dá)量的log2值進(jìn)行聚類，紅色表示高表達(dá)蛋白質(zhì)，綠色表示低表達(dá)蛋白質(zhì)

試驗(yàn)組(妊娠)與對(duì)照組(非妊娠)相比，上調(diào)蛋白19個(gè)，下調(diào)蛋白5個(gè)

2.3 差異表達(dá)蛋白GO富集分析

參考豬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)注解的蛋白質(zhì)功能，進(jìn)行差異蛋白的功能分類(表3)。GO注釋顯示，差異蛋白主要涉及了線粒體DNA代謝、端粒維持、細(xì)胞通訊、細(xì)胞生長(zhǎng)、補(bǔ)體激活及天然免疫應(yīng)答、細(xì)胞骨架和雌激素激活等生物學(xué)功能，這些功能與早期胚胎發(fā)育及胚胎附植存在緊密聯(lián)系。

表3 與動(dòng)物繁殖及胚胎發(fā)育相關(guān)的GO功能類別

2.4 差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析

差異蛋白KEGG富集分析結(jié)果顯示，共富集到43條KEGG通路，從中篩選了16條可能與動(dòng)物繁殖及胚胎發(fā)育相關(guān)的通路列于表4，對(duì)差異表達(dá)蛋白KEGG注釋結(jié)果進(jìn)行分類。KEGG分析顯示，差異蛋白所涉及的通路主要包括PI3K-Akt、p53、MAPK、Estrogen和mTOR等多條信號(hào)通路，這些細(xì)胞信號(hào)通路在胚胎附植期中具有關(guān)鍵作用。結(jié)果還顯示了差異蛋白參與了造血細(xì)胞譜系和同種異體移植排斥兩條信號(hào)通路。

表4 與動(dòng)物繁殖及胚胎發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路

2.5 差異表達(dá)蛋白ELISA驗(yàn)證分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證iTRAQ檢測(cè)的蛋白表達(dá)結(jié)果，本研究使用ELISA技術(shù)對(duì)以上4個(gè)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明4個(gè)蛋白在兩組中的表達(dá)情況與iTRAQ檢測(cè)結(jié)果一致，該結(jié)果驗(yàn)證了iTRAQ結(jié)果的可信度(圖4)。

肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)

2.6 差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析

蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的主要組成部分，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)對(duì)細(xì)胞及其信號(hào)的調(diào)控有重要意義。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找差異蛋白中與早期胚胎發(fā)育、胚胎附植等生物學(xué)現(xiàn)象或信號(hào)通路有關(guān)的蛋白，最終選出了FLNC、ADIPOQ、HP及TERF2等4個(gè)蛋白利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。

圖5 胚胎附植相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示單個(gè)蛋白，線表示它們之間的關(guān)系。結(jié)果表明，同一個(gè)蛋白可能參與了許多不同生理過程，如MAPK通路、PI3K-Akt通路、雌激素激活等。除了APOE、F2、APOA1等節(jié)點(diǎn)外，PPI網(wǎng)絡(luò)中HP、FLNC等蛋白也為主要樞紐蛋白。提示我們鑒定到的差異蛋白可能與早期胚胎附植存在緊密的聯(lián)系并可能通過參與這些信號(hào)通路來影響豬早期胚胎植入，進(jìn)而影響豬的繁殖。

2.7 受試者工作特征曲線(ROC)分析

驗(yàn)證組樣本經(jīng)去除豬場(chǎng)自淘母豬及不合格樣品且經(jīng)2次B超復(fù)檢診斷妊娠后，最終可以使用的樣品數(shù)量為配種后15 d母豬21頭，其中妊娠17頭，未妊娠4頭，剔除9頭。采用以上全部合格樣品豬的血液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)ELISA試驗(yàn)結(jié)果，分別進(jìn)行ROC曲線分析，并計(jì)算其AUC面積及置信度(圖6)，將差異蛋白作為生物標(biāo)志物將預(yù)測(cè)結(jié)果分析(表5)。結(jié)果顯示，F(xiàn)LNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP的AUC面積分別為0.882、0.985、0.941、1.000、1.000、1.000，且均有較高的顯著性；在真陽(yáng)性率方面(妊娠母豬診斷為妊娠狀態(tài))也均有較高的準(zhǔn)確性，分別為88.2%、94.1%、82.4%、100%、100%和100%。

表5 差異蛋白作為生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)結(jié)果分析

A.FLNC的ROC分析曲線；B.ADIPOQ的ROC分析曲線；C.HP的ROC分析曲線；D.TERF2的ROC分析曲線；E.FLNC-ADIPOQ的ROC分析曲線；F.ADIPOQ-HP的ROC分析曲線

3 討 論

在生物體內(nèi)，某些特定蛋白的豐度變化往往預(yù)示著該生物體相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的轉(zhuǎn)變。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，系統(tǒng)識(shí)別和蛋白質(zhì)的定量顯得尤為重要[16]。iTRAQ技術(shù)是新興的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，在蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量和結(jié)果的可靠性及可重復(fù)性上具有優(yōu)勢(shì)。它特別適用于篩查血清或血漿中的生化標(biāo)記[17-18]。本研究對(duì)配種后第15天妊娠與非妊娠組母豬外周血液中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)情況展開了研究，共鑒定到蛋白917個(gè)，其中24個(gè)差異表達(dá)蛋白，上調(diào)蛋白19個(gè)，下調(diào)蛋白5個(gè)。通過GO注釋和KEGG分析，進(jìn)一步篩選了4個(gè)與胚胎附植相關(guān)的差異蛋白——FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2，經(jīng)ELISA驗(yàn)證和ROC曲線分析，其可作為母豬早期妊娠診斷的潛在生物標(biāo)志物。

在人類子宮內(nèi)膜基質(zhì)[19]和蛻膜[20]中發(fā)現(xiàn)了HP的表達(dá)和定位，表明其可能在著床期起作用，這可能與靈長(zhǎng)類動(dòng)物胚胎的深層間質(zhì)植入有關(guān)。HP在母豬發(fā)情周期不同階段的輸卵管和子宮中存在，豬輸卵管和子宮中HP蛋白的mRNA的表達(dá)在發(fā)情周期黃體晚期最為豐富，表明它在生殖過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在體外胚胎生產(chǎn)過程中加入結(jié)合珠蛋白可提高囊胚率[21]。妊娠第12天子宮內(nèi)膜蛋白豐度研究中，HP表達(dá)量增加了10倍。這種妊娠引起的HP增加可能是由于其免疫調(diào)節(jié)和血管生成的特性[22]。此外，在包括人類、牛和狗在內(nèi)的一些物種中，HP在維持、配子結(jié)合、受精和妊娠期間母體-胎兒免疫耐受的生殖過程中起著基礎(chǔ)作用[20,23-24]。在植入期子宮內(nèi)膜中，HP蛋白mRNA特異性表達(dá)，而在發(fā)情期或假孕第4天子宮內(nèi)膜中則無表達(dá)[24-25]。

女性在月經(jīng)周期的分泌中期觀察到較高的AdipoR1和AdipoR2基因表達(dá)，這表明胚胎植入準(zhǔn)備過程中子宮內(nèi)膜的變化可能有脂聯(lián)素的參與。體外試驗(yàn)證明，ADIPOQ可以提高豬胚胎發(fā)育到囊胚的成功率[26]。AdipoR1和AdipoR2在人[27]和豬[28]子宮內(nèi)膜中的存在及其在月經(jīng)周期分泌中期的表達(dá)水平升高，首次證明ADIPOQ可能在胚胎植入中起關(guān)鍵作用。

還有研究指出，反復(fù)胚胎種植失敗小鼠內(nèi)膜脂聯(lián)素受體表達(dá)顯著下調(diào)，推測(cè)脂聯(lián)素異常調(diào)節(jié)對(duì)胚胎著床產(chǎn)生影響[29]。ADIPOQ能促進(jìn)子宮蛻膜組織中 FOXO3 蛋白表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)其影響子宮蛻膜化過程，維持妊娠早期免疫耐受[30-31]。Salker等[32]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制PI3K/Akt可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中SGK1活性增強(qiáng)，破壞胚胎間距和早期的胎盤-蛻膜相互作用，阻止胚胎著床。同源性磷酸酶張力蛋白(PTEN)是目前發(fā)現(xiàn)的PI3K/Akt中最主要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，PI3K/Akt的激活受體內(nèi)PTEN的影響，其異常升高會(huì)抑制PI3K/Akt活性并使下游的MMP-9表達(dá)下調(diào)，使子宮內(nèi)膜受滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力不夠，影響早期胚胎發(fā)育及著床[33-34]。

本研究在妊娠母豬早期血液中檢測(cè)到的相關(guān)差異蛋白表達(dá)量的變化趨勢(shì)，與前人在其他物種妊娠早期子宮內(nèi)膜等組織中的研究存在相似性，這也證實(shí)了本研究的可靠性。

目前，豬妊娠早期生物標(biāo)志物的研究較少。Shen等[35]發(fā)現(xiàn)，妊娠母豬血液中差異表達(dá)mRNA(LPAR3、RXFP4、GALP、CBR1、CBR2、GPX6、USP18、LHB和NR5A1)參與母豬早期妊娠調(diào)控，并可能作為母豬早期妊娠診斷的分子標(biāo)記物。本研究中的ROC曲線分析結(jié)果表明，F(xiàn)LNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP的真陽(yáng)性率(妊娠母豬診斷為妊娠狀態(tài))均有較高的準(zhǔn)確性，分別為88.2%、94.1%、82.4%、100%、100%和100%；ADIPOQ、HP及TERF2的假陽(yáng)性率(未妊娠母豬診斷為妊娠狀態(tài))為0，F(xiàn)LNC為25%。真陰性率(未妊娠母豬診斷為未妊娠狀態(tài))ADIPOQ、HP及TERF2均達(dá)到100%，F(xiàn)LNC為75%。而假陰性率(妊娠母豬診斷為未妊娠狀態(tài))TERF2為0，ADIPOQ為5.9%，F(xiàn)LNC為11.8%，HP為17.6%。FLNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP在診斷母豬妊娠狀態(tài)的準(zhǔn)確率分別為85.71%、95.24%、85.71%、100%、100%和100%。這表明，配種后15 d妊娠與未妊娠母豬外周血液中差異蛋白FLNC、ADIPOQ、HP及TERF2適合作為豬早期妊娠診斷的潛在生物標(biāo)志物。

4 結(jié) 論

本研究利用iTRAQ技術(shù)篩選配種后15 d妊娠與非妊娠母豬外周血液中的蛋白，發(fā)現(xiàn)24個(gè)蛋白存在差異表達(dá)(P<0.05)，其中存在4個(gè)與胚胎附植相關(guān)的差異表達(dá)蛋白(FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2)。ROC曲線分析結(jié)果也進(jìn)一步表明，配種后15 d母豬外周血液中的差異表達(dá)蛋白FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2可作為母豬早期妊娠的潛在生物標(biāo)志物，為母豬胚胎附植機(jī)制研究提供了新的思路。