余永濤，毛彥妮，趙清梅，李金榮，白曉南，薛佳祺，張浩東

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；3.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

瘋草是豆科棘豆屬(Oxytropis)和黃芪屬(Astragalus)有毒植物的統(tǒng)稱[1-2]，動(dòng)物過量采食瘋草會(huì)發(fā)生以神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能紊亂為特征的慢性中毒病[3-4]?？囫R豆素(swainsonine, SW)是瘋草的主要毒性成分，由瘋草中的鏈格孢屬波狀芽管孢組(AlternariaSectionUndifilumspp)內(nèi)生真菌產(chǎn)生[5-7]，該類內(nèi)生真菌包括棘豆鏈格孢菌(Alternariaoxytropis)、A.fulvum和A.cinereum等3個(gè)種。目前，瘋草內(nèi)生真菌合成SW的機(jī)制仍未闡明，該機(jī)制的闡釋可為從控制內(nèi)生真菌角度預(yù)防動(dòng)物瘋草中毒病提供新思路。據(jù)報(bào)道，酵母氨酸還原酶、酵母氨酸脫氫酶、酵母氨酸氧化酶、吡咯-5-羧酸還原酶、聚酮合酶和細(xì)胞色素氧化酶P450等基因可能是棘豆鏈格孢菌中參與SW合成的關(guān)鍵基因[8-10]，但上述基因的具體功能及其在棘豆鏈格孢菌SW合成中的作用機(jī)制仍不清楚。

研究表明，植物病原真菌豆類絲核菌(Slafractonialeguminicola)、昆蟲病原真菌金龜子綠僵菌(Metarhiziumrobertsii)、番薯屬植物表生菌(Chaetothyriaceaespp)、人和動(dòng)物皮膚病原真菌Trichophytonspp和Arthrodermaspp等也可產(chǎn)生SW[11-13]。比較基因組學(xué)研究表明，上述真菌中均存在一類高度同源、結(jié)構(gòu)相似的I型聚酮合酶(type I polyketides synthetase, T1-PKS)基因簇，T1-PKS基因簇廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物中，負(fù)責(zé)次生代謝產(chǎn)物的合成[11]。Cook等[11]將綠僵菌中該基因簇的swnK基因敲除后，敲除菌株不再產(chǎn)生SW，確定該基因簇在綠僵菌SW生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并將產(chǎn)SW真菌中的這一類基因簇統(tǒng)一命名為SW合成基因簇(swainsonine biosynthesis gene cluster，SWN)。SWN基因簇主要由swnR、swnN、swnH1、swnH2、swnK等基因組成，在棘豆鏈格孢菌SWN基因簇5′端還存在一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白基因(amino-acid transporter-like，AATL)。swnK是SWN基因簇中最主要的基因，由具有腺苷酰化作用區(qū)域(adenylylation，A)、2個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺結(jié)合作用區(qū)域(phosphopantetheine-binding/thiolation，T)、β-聚酮合酶(β-ketoacyl synthase，KS)，?；D(zhuǎn)移酶(acyltransferase，AT)，β-酮酯?；€原酶(β-ketoacyl reductase，SDR)和硫酯還原酶(thioester reductase，SDRe1)等多個(gè)功能區(qū)組成(圖1)。功能預(yù)測分析表明，swnK可能編碼從L-哌可酸到1羥基吲哚里西啶形成之前6步酶促反應(yīng)所需的多功能復(fù)合酶。而swnR、swnN、swnH1、swnH2等基因可能分別編碼從1羥基吲哚里西啶到SW的3步酶促反應(yīng)所需的酶[11-12]。但迄今為止，棘豆鏈格孢菌SWN基因簇中各基因的功能仍未經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，其功能和SW合成途徑是否與預(yù)測結(jié)果一致還有待進(jìn)一步研究。

圖1 棘豆鏈格孢菌的SWN基因簇

從不同種瘋草中分離到不同的棘豆鏈格孢菌菌株，雖然這些菌株生長特性和顯微形態(tài)相近，且在遺傳進(jìn)化上高度同源，但不同菌株在SW合成、分生孢子產(chǎn)生等方面存在顯著差異[14-16]。近年來，一些未被歸類到瘋草的豆科植物中也分離到鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌，如Alternariabornmuelleri和甘肅鏈格孢菌(Alternariagansuense)，但它們均為植物病原真菌，僅能產(chǎn)生極微量的SW。進(jìn)一步的研究表明，這兩種病原真菌基因組中也存在與棘豆鏈格孢菌高度同源的SWN基因簇[17-19]。因此，需要對(duì)棘豆鏈格孢菌等瘋草內(nèi)生真菌和甘肅鏈格孢菌等病原真菌SWN基因簇各基因的功能及其在SW合成的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。

目前，棘豆鏈格孢菌SWN基因簇各基因表達(dá)水平的變化是否與真菌的SW合成相關(guān)仍未見報(bào)道。本研究擬對(duì)棘豆鏈格孢菌野生型菌株UA003進(jìn)行EMS誘變處理，測定各菌株菌絲中SW的含量，篩選SW產(chǎn)率顯著變化的誘變菌株。然后對(duì)棘豆鏈格孢菌野生型菌株、SW產(chǎn)率發(fā)生顯著變化的EMS誘變菌株及僅能產(chǎn)生微量SW的甘肅鏈格孢菌SWN基因簇各基因表達(dá)模式和swnK基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，探究其基因表達(dá)變化的原因。通過上述研究，初步了解棘豆鏈格孢菌SWN基因簇各基因的表達(dá)模式及其與SW合成的關(guān)系，以期為進(jìn)一步闡明棘豆鏈格孢菌SWN基因簇中各基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 棘豆鏈格孢菌AlternariaSectionUndifilumOxytropis(=AlternariaOxytropis)UA003菌株，分離自變異黃芪[20]；甘肅鏈格孢菌AlternariaSectionUndifilumgansuense(=Alternariagansuense)EA菌株分離自直立黃芪[19]。

1.1.2 儀器與試劑 Simpli Nano超微量分光光度計(jì)，美國GE公司；qTOWER 2.2熒光定量PCR儀，德國Jena公司；總RNA提取試劑(TaKaRa RNAiso Plus)、primeScript RT reagent kit with a gDNA eraser和B GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ購自寶生物工程有限公司；蝸牛酶、溶壁酶、纖維素酶、甲基磺酸乙酯(EMS)購于Sigma公司；無水乙醇、三氯甲烷和異丙醇購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)原液購自北京天根生化有限公司。相關(guān)引物(表1、表2)由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 Real-time PCR引物序列

表2 swnK基因擴(kuò)增引物序列

1.2 方 法

1.2.1 棘豆鏈格孢菌原生質(zhì)體制備 將棘豆鏈格孢菌UA003菌株接種于PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)20～30 d。將培養(yǎng)的真菌菌落制成6 mm直徑的菌餅，接種于裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)15 d。用神奇濾布過濾菌液，并用0.6 mol·L-1MgSO4溶液洗滌菌絲。稱量100 mg菌絲，按質(zhì)量體積比1∶10加入纖維素酶、溶壁酶和蝸牛酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1∶1∶1.2的酶解液，室溫90 r·min-1孵育2 h。用神奇濾布過濾酶解消化的菌絲，獲得原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入50 mL離心管中室溫4 000 r·min-1離心。去上清后，在離心管中加入10 mL STC buffer重懸細(xì)胞，4 000 r·min-1離心。棄去上清，在離心管中加入1 mL STC buffer重懸細(xì)胞，取少量懸液滴入血球計(jì)數(shù)板中，置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后加入適量STC buffer調(diào)節(jié)原生質(zhì)體濃度至1×105～1×106個(gè)·mL-1備用。

1.2.2 原生質(zhì)體EMS誘變處理 取100 μL原生質(zhì)體懸液，加入不同體積10 mol·L-1EMS原液，混勻，使EMS工作濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mol·L-1。分別置恒溫?fù)u床200 r·min-1室溫孵育20、30 min，反應(yīng)結(jié)束后10 000 r·min-1離心6 min，棄上清。向離心管中加入100 μL STC buffer重懸細(xì)胞，將混懸液均勻涂布于再生培養(yǎng)基上，20 ℃恒溫培養(yǎng)。每個(gè)濃度做3組平行處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，對(duì)照組不加EMS。

1.2.3 誘變菌株篩選 隨機(jī)挑取經(jīng)EMS誘變處理和未經(jīng)EMS處理的再生菌落，接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d。分別收集PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的各菌株新鮮菌絲0.5～1.0 g，液氮冷凍研磨成粉末并干燥。將粉末置于裝有5 mL甲醇的10 mL離心管中，30 ℃超聲提取30 min。每個(gè)菌株同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，每個(gè)樣品提取3次，合并提取液，然后減壓揮干溶劑。粗提物用適量甲醇溶解并用0.22 μm孔徑濾膜過濾，定容至5 mL，制成待檢液。采用張蕾蕾等[21]報(bào)道的α-甘露糖苷酶抑制法對(duì)菌絲中SW含量進(jìn)行測定。比較經(jīng)EMS誘變處理的誘變菌株和未經(jīng)EMS處理的野生型菌株菌絲中的SW含量，篩選SW含量發(fā)生顯著變化的誘變菌株。將對(duì)照菌株和篩選所得的SW含量發(fā)生顯著變化的誘變菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)傳代培養(yǎng)3代，分別測定每代真菌菌絲中的SW含量，進(jìn)一步篩選與對(duì)照菌株SW合成差異顯著、且始終穩(wěn)定的EMS誘變菌株。

1.2.4 真菌總RNA提取 收集PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d的棘豆鏈格孢菌野生型菌株UA003、SW含量發(fā)生顯著變化的EMS誘變菌株和甘肅鏈格孢菌EA菌株的真菌菌絲50～100 mg，用液氮將其研磨成粉末。將粉末轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，按照試劑盒說明書提取各樣品總RNA，測定總RNA濃度，并用電泳對(duì)RNA的完整性進(jìn)行評(píng)估。

1.2.5 cDNA合成 以真菌總RNA為模板，按照試劑盒操作說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。去基因組DNA反應(yīng)體系為5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 90 ng，添加RNase Free ddH2O到10 μL。反應(yīng)參數(shù)為42 ℃ 2 min，然后4 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為去基因組DNA后的反應(yīng)液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5× PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.6 EMS誘變菌株與野生型菌株中SWN基因簇各基因表達(dá)分析 根據(jù)Cook等[11]報(bào)道的棘豆鏈格孢菌SWN基因簇中AATL、swnR、swnN、swnH1、swnH2、swnK(A、AT、KS、SDRe1、SDR)各基因的序列信息，利用NCBI中的BLAST-Primer軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。使用TaKaRa SYBR Green I Real-time PCR試劑盒進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分別以β-actin和GAPDH為內(nèi)參基因，以dd H2O為陰性對(duì)照，反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板按下列組分配制PCR反應(yīng)液，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為TB Green Premix ExTaqⅡ(RNaseH Plus)10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free dd H2O 6 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。將各組所得Ct值分別以β-actin和GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參校正，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各菌株不同基因的表達(dá)量，ΔΔCt=[Ct(處理組目的基因)-Ct(處理組內(nèi)參基因)]-[Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因)]。

1.2.7swnK基因的擴(kuò)增與突變位點(diǎn)分析 收集棘豆鏈格孢菌UA003、SW含量發(fā)生顯著變化的EMS誘變菌株和甘肅鏈格孢菌EA菌株真菌菌絲100 mg，液氮研磨至粉末，并轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。然后按照試劑盒說明書提取DNA，測定各樣品的DNA濃度。使用表2中的引物對(duì)swnK基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)片段同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。擴(kuò)增體系為rTaq酶 0.5 μL，10× PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，F(xiàn)-Primer 0.5 μL，R-Primer 0.5 μL，DNA模板0.5 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸 10 min。

將每個(gè)基因片段的3個(gè)平行重復(fù)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，均送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序，應(yīng)用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)﹄p向測序片段進(jìn)行拼接，使用DNAMAN 8軟件中的ClustalW程序?qū)ζ唇雍玫膕wnK基因進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 使用IBM SPSS Statistics 20和GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差法對(duì)各組真菌的SW含量及各基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析。

2 結(jié) 果

2.1 EMS誘變菌株的篩選

隨著EMS工作濃度的增加，菌株致死率也隨之增高。當(dāng)EMS工作濃度為0.06和0.08 mol·L-1時(shí)，真菌的死亡率為100%，但當(dāng)EMS工作濃度為0.02和0.04 mol·L-1時(shí)，再生培養(yǎng)基上均有菌株存活。本研究隨機(jī)挑取了34株經(jīng)EMS誘變處理且能夠在再生培養(yǎng)基生長的菌株，并分別對(duì)上述菌株和對(duì)照菌株真菌菌絲的SW含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，當(dāng)EMS工作濃度為0.02 mol·L-1，處理30 min，再生后隨機(jī)挑選的所有菌株，其SW含量均高于對(duì)照菌株。經(jīng)初步篩選，共有12株EMS誘變處理菌株的SW含量與對(duì)照菌株相比發(fā)生了顯著改變。本研究對(duì)初步篩選所得的12株菌株進(jìn)行了連續(xù)3代的傳代培養(yǎng)和SW檢測，其中誘變菌株的SW含量經(jīng)連續(xù)3代培養(yǎng)后始終與對(duì)照組差異顯著且高于對(duì)照菌株的有E02、E23和E25等。SW測定結(jié)果表明，對(duì)照菌株UA003中SW含量為(0.087±0.004)mg·g-1菌絲干重，EMS誘變菌株E02、E23、E25的SW含量均顯著高于對(duì)照菌株UA003(P<0.05或P<0.01)，其中E02菌株的SW含量最高，為(0.202±0.006)mg·g-1，極顯著高于對(duì)照菌株UA003(P<0.01)(圖2)。此外本研究也測定了甘肅鏈格孢菌EA菌株的SW含量，其SW含量僅為(0.004±0.001)mg·g-1菌絲干重，極顯著低于其他菌株(P<0.01)。

與對(duì)照組(UA003)比較，*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)

2.2 誘變菌株與野生型菌株中SWN基因簇各基因的表達(dá)分析

如表3所示，當(dāng)以β-actin為內(nèi)參基因時(shí)，與UA003菌株相比，AATL、swnR、swnN、swnH1及swnH2在EA、E02、E23和E25菌株中表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。A、KS、SDR和SDRe1基因在EA、E02、E23和E25菌株中表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，而AT基因在E23菌株中表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.01)，在EA、E02和E25菌株中表達(dá)則極顯著下調(diào)(P<0.01)。

由表3所示，當(dāng)以GAPDH為內(nèi)參基因時(shí)，與UA003菌株相比，AATL、swnR、swnN、swnH1及swnH2在EA、E02、E23和E25菌株中表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。A、KS、SDR和SDRe1基因在EA、E02、E23和E25菌株中表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.05)，但AT基因僅在E23菌株中表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，在EA、E02和E25菌株中的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。

表3 SWN基因簇各基因的相對(duì)表達(dá)量

2.3 swnK基因突變位點(diǎn)分析

測序結(jié)果表明，UA003、E02、E23、E25和EA等5株真菌的swnK基因序列與已公開的棘豆鏈格孢菌的swnK基因(GenBank登錄號(hào)為KY365741.1)均具有較高一致性。

UA003、E23、E25等3菌株swnK基因序列完全一致，與已公布的棘豆鏈格孢菌swnK基因序列(KY365741.1)一致性為99.97%，僅有2處堿基存在差異，均在SDR區(qū)域，但其編碼的氨基酸序列與KY365741.1完全一致。E02菌株swnK基因序列與KY365741.1的序列一致性為99.80%，與UA003的swnK基因序列一致性為99.83%。與UA003相比，E02共有13個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生了突變，其中，轉(zhuǎn)換突變有11個(gè)位點(diǎn)(G16756A、G16871A、G16939A、T16993C、T17189C、A17305G、C17429T、T17446C、G17502A、C17505T、A17307G)，顛換突變有2個(gè)位點(diǎn)(G16997A、T17280C)，分別位于swnK基因KS區(qū)域上游的A、T區(qū)域(圖3A)，其編碼的氨基酸序列共有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變(D403N、L445V、S509P、G613D、A614V、S615G)(圖3B)。

甘肅鏈格孢菌EA菌株的swnK基因與KY365741.1序列一致性為97.55%，與UA003swnK基因序列一致性為97.80%。與KY365741.1相比，EA菌株共有163個(gè)位點(diǎn)的堿基不同，分布于swnK基因的非編碼區(qū)和編碼區(qū)的各個(gè)區(qū)域，其編碼的氨基酸序列有67個(gè)位點(diǎn)不同，位于swnK基因的各個(gè)區(qū)域。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的起始段缺失了一段由15個(gè)氨基酸組成的肽鏈(MLTPAVSLKNLTKPK)，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的1 135與1 143處(KY365741.1中對(duì)應(yīng)的位置)插入了一條由7個(gè)氨基酸組成的短肽(TEVDGVP)(圖3C)。

3 討 論

棘豆鏈格孢菌SW合成能力及其在宿主植物組織中的生物量與宿主中SW的含量緊密相關(guān)[15]。據(jù)報(bào)道，棘豆鏈格孢菌SW合成能力受底物、環(huán)境、菌株等因素的影響[22-23]。棘豆鏈格孢菌SWN基因簇相關(guān)基因可能是真菌SW生物合成的關(guān)鍵基因[11]，但相關(guān)基因表達(dá)水平與SW合成存在何種聯(lián)系仍有待進(jìn)一步研究。目前，人們從不同種瘋草中分離到不同的棘豆鏈格孢菌菌株，由于環(huán)境和遺傳等因素的影響，直接分析不同來源的菌株SWN基因簇各基因的表達(dá)水平，并不能真實(shí)的反映各菌株SW合成能力與SWN基因簇各基因表達(dá)水平的相關(guān)性。因此，本研究對(duì)棘豆鏈格孢菌野生型菌株UA003進(jìn)行了EMS誘變處理，對(duì)經(jīng)EMS誘變處理并能再生的誘變菌株進(jìn)行了篩選，篩選出與野生型菌株SW合成能力差異顯著的突變菌株，以此為研究模型來分析SWN基因簇各基因表達(dá)水平的變化與SW合成的關(guān)系。在本研究中，突變菌株E02、E23和E25由野生型菌株UA003誘變而來，其遺傳背景與UA003相同，比較分析其與野生型菌株UA003菌株SWN基因簇各基因的表達(dá)模式，從理論上來說能夠更為真實(shí)地反映真菌SW合成與SWN基因簇各基因之間的關(guān)系。

在本研究中，E02、E23和E25菌株經(jīng)EMS誘變處理后，SW生物合成能力顯著升高。與UA003相比，3株誘變菌株SWN基因簇各基因表達(dá)水平也顯著改變。其中swnK中A、KS、SDR、SDRel等基因的表達(dá)均顯著上調(diào)，其表達(dá)模式與SW合成呈正相關(guān)。而AATL、swnR、swnN、swnH1及swnH2基因表達(dá)均顯著下調(diào)，其表達(dá)模式與SW產(chǎn)率呈負(fù)相關(guān)。而swnK中的AT基因在E02、E25菌株中表達(dá)顯著下調(diào)，呈現(xiàn)出與swnK中A、KS、SDR、SDRel等基因相反的表達(dá)模式。在金龜子綠僵菌的研究中，swnH2基因的表達(dá)水平與SW合成呈負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)果相一致，但swnR基因表達(dá)水平與SW合成呈正相關(guān)，而swnH1、swnK、swnN等基因表達(dá)與SW合成未表現(xiàn)出相關(guān)性[24]，該研究也表明，金龜子綠僵菌中SWN基因簇各基因的表達(dá)模式可能不同于棘豆鏈格孢菌。在本研究中，E02、E23和E25菌株來源于野生型菌株UA003，但各菌株的SW產(chǎn)率和SWN基因簇各基因表達(dá)模式發(fā)生了顯著變化，應(yīng)該是由于EMS誘導(dǎo)野生型菌株基因組中的堿基突變，導(dǎo)致了相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和功能的改變，抑制了AATL、swnR、swnN、swnH1、swnH2等基因的表達(dá)，增強(qiáng)了swnK基因的表達(dá)，但swnK基因表達(dá)的增強(qiáng)是否是導(dǎo)致誘變菌株SW合成增加的直接原因還有待進(jìn)一步研究。

EMS是一種可改變DNA結(jié)構(gòu)的高效烷化劑，能在基因組中引發(fā)多個(gè)位點(diǎn)的突變[25-28]。EMS通過不同的方式引發(fā)轉(zhuǎn)換型突變、顛換型突變或造成染色體片段的缺失[29]。本研究中，突變菌株E02swnK基因編碼區(qū)13個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生了突變，分別位于A、T區(qū)域，其中11個(gè)位點(diǎn)為轉(zhuǎn)換型突變，2個(gè)位點(diǎn)為顛換型突變，而swnK基因5′端的上游非編碼區(qū)序列未發(fā)生突變。E02菌株swnK基因的突變使其編碼產(chǎn)物中6個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)義突變，可能會(huì)導(dǎo)致swnK基因表達(dá)水平和功能的改變。盡管E23、E25菌株SWN基因簇中各基因的表達(dá)模式與E02相似，然而這兩株突變菌株swnK基因編碼區(qū)及其5′端上游非編碼區(qū)序列未發(fā)生突變。在真菌基因表達(dá)調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)由位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的非編碼區(qū)順式作用元件，以及可與非編碼區(qū)或編碼區(qū)互作的反式作用因子、RNA聚合酶等共同參與。啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、抑制子等順式作用元件，通過引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄起始來調(diào)控轉(zhuǎn)錄頻率。而轉(zhuǎn)錄因子等反式作用因子，則能與基因5`端上游非編碼區(qū)特定序列專一性結(jié)合，通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間的表達(dá)[30-31]。在本研究中，E02、E23和E25等3株突變菌株swnK基因的表達(dá)水平與野生型菌株相比均發(fā)生了顯著變化，但swnK基因5′端上游非編碼區(qū)序列(順式作用元件)并未發(fā)生突變。表明3株突變菌株swnK基因表達(dá)水平變化與啟動(dòng)子等順式作用元件無關(guān)，其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可能是由轉(zhuǎn)錄因子等反式作用因子或RNA聚合酶等其他元件來調(diào)節(jié)。目前仍不清楚與swnK基因互作的反式作用因子有哪些，上述誘變菌株中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因是否也發(fā)生了突變?nèi)圆磺宄?。由于棘豆鏈格孢菌SWN基因簇全長約23 kb，受研究成本限制，本研究并未對(duì)AATL、swnR、swnN、swnH1及swnH2等基因及其非編碼區(qū)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，這些基因核苷酸序列是否發(fā)生了突變，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或基因表達(dá)水平的變化仍不清楚。進(jìn)一步的研究應(yīng)結(jié)合全基因組測序、SNP等分析技術(shù)，對(duì)誘變菌株突變位點(diǎn)進(jìn)行全面分析，這將為進(jìn)一步揭示SWN基因簇各基因的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

在本研究中，甘肅鏈格孢菌EA菌株分離自直立黃芪，同屬于鏈格孢屬波狀芽管孢組真菌，其基因組中同樣存在與棘豆鏈格孢菌高度同源的SWN基因簇，但該菌僅能產(chǎn)生極微量的SW。在以UA003為對(duì)照時(shí)，EA菌株呈現(xiàn)出與E02、E23和E25等菌株相同的表達(dá)模式，盡管培養(yǎng)條件一致，但EA菌株與UA003、E02、E23和E25等菌株的遺傳背景和來源不同。突變位點(diǎn)分析結(jié)果表明，與棘豆鏈格孢菌相比，EA菌株swnK基因序列共有163個(gè)位點(diǎn)不同，分布于swnK基因的非編碼區(qū)和編碼區(qū)的各個(gè)區(qū)域，其編碼的氨基酸序列也有67個(gè)位點(diǎn)不同，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)也不同，表達(dá)產(chǎn)物缺失了一段由15個(gè)氨基酸組成的肽鏈，在AT區(qū)域還插入了一段由7個(gè)氨基酸組成的短肽，上述位點(diǎn)的差異表明，甘肅鏈格孢菌EA菌株swnK基因的結(jié)構(gòu)和功能必然與同屬的棘豆鏈格孢菌等瘋草內(nèi)生真菌不同。因此，以UA003為對(duì)照菌株，并不能客觀地反映EA菌株SWN基因簇各基因的表達(dá)模式及其與SW產(chǎn)率的關(guān)系。進(jìn)一步的研究需要對(duì)甘肅鏈格孢菌和棘豆鏈格孢菌SWN基因簇各基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行比較分析，這將為闡明棘豆鏈格孢菌等瘋草內(nèi)生真菌SWN基因簇各基因的功能及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

EMS能顯著改變棘豆鏈格孢菌的苦馬豆素合成能力和SWN基因簇各基因的表達(dá)水平。棘豆鏈格孢菌SWN基因簇中AATL、swnR、swnN、swnH1、swnH2等基因的表達(dá)模式與苦馬豆素合成呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢，A、KS、SDR和SDRe1等基因的表達(dá)模式與苦馬豆素合成呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢，EMS突變菌株苦馬豆素的合成的變化可能與SWN基因簇相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和功能的變化有關(guān)。本研究可為進(jìn)一步闡明棘豆鏈格孢菌等瘋草內(nèi)生真菌SWN基因簇中各基因的功能奠定基礎(chǔ)。