李旭照，王 海，白 檳，馬立旭，趙建寧，王寧萍

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年新增結(jié)直腸癌病例約140萬，死亡約有77.4萬人[1]。我國調(diào)查發(fā)現(xiàn)每年新發(fā)結(jié)直腸癌超過60萬，男性結(jié)直腸癌發(fā)病率已經(jīng)上升為第2位，女性則上升為第3位。西北地區(qū)結(jié)直腸癌發(fā)病率亦呈明顯上升趨勢，且發(fā)病年齡有所提前[2]。但是，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不清楚，需要進(jìn)一步研究闡述，旨在發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)策略與靶點。越來越多的研究表明，腸道菌群失調(diào)在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[3]。腸道菌群是機(jī)體腸道內(nèi)定植微生物的總稱，包括細(xì)菌、病毒、真菌等，其總量是機(jī)體細(xì)胞數(shù)量的10倍以上，數(shù)量龐大。經(jīng)過長期的進(jìn)化，腸道菌群已與機(jī)體融為一體，作為一種“特殊器官”，正常情況下，作為腸道共生菌協(xié)助機(jī)體各項功能。但在異常情況下，腸道菌群已被證實參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其在結(jié)直腸癌中，由于腸道菌群主要定植在結(jié)直腸，所以能直接作用于腸道細(xì)胞，與該病密切相關(guān)[4]，因此，研究結(jié)直腸癌的腸道菌群意義重大。本研究試圖通過分析結(jié)直腸癌患者與健康對照者的腸道菌群組成差異，篩選出顯著差異菌及其代謝產(chǎn)物，明確結(jié)直腸癌相關(guān)的關(guān)鍵菌及產(chǎn)物，為后續(xù)利用腸道菌群干預(yù)防治結(jié)直腸癌提供幫助。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑：Multiskan GO全自動酶標(biāo)儀、TRACE 1310-ISQ LT氣-質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛。鱟試劑檢測試劑盒，廈門鱟試劑；短鏈脂肪酸(SCFAs)標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-aldrich；PCR引物，上海生工；PCR反應(yīng)采用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix試劑盒，New England Biolabs。

1.2 糞便標(biāo)本收集：收集寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2019至2020年健康對照組人群44例、確診結(jié)直腸癌患者29例臨床資料。健康對照組中男性25例，女性19例；年齡 40～70歲，平均50歲；結(jié)直腸癌患者中男性16例，女性13例；年齡39～75歲，平均52歲，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)直腸癌糞便樣本資料為住院患者，健康對照組糞便樣本來自體檢中心。樣本收集標(biāo)準(zhǔn)：收集樣本前1個月內(nèi)未口服抗生素或益生菌制劑；結(jié)直腸癌患者為初次發(fā)現(xiàn)，無放化療史，糞便標(biāo)本在結(jié)腸鏡下術(shù)前采集。健康對照除未罹患結(jié)直腸癌，其他資料與結(jié)直腸癌組一致。糞便標(biāo)本凍存于-80 ℃用于后續(xù)腸道菌群測序。本研究經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.3 16S rRNA腸道菌群測序與分析：待各組收齊后，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法[5]提取糞便樣本DNA。經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定后，采用細(xì)菌V3～V4區(qū)引物(341F 5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’和806R 5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建庫后送北京諾禾致源公司采用Illumina HiSeq 2500測序平臺測序及分析。

1.4 鱟試劑法檢測血漿脂多糖( LPS)水平：采用鱟試劑盒按說明書檢測各組血漿LPS水平。

1.5 氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)檢測短鏈脂肪酸(SCFAs)：采用美國Thermo公司的TRACE 1310-ISQ LT氣-質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為Agilent HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm)。分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μl，分流比為10∶1。進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃。程序升溫起始溫度90 ℃，然后以10 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至150 ℃，最后以25 ℃/min 升溫至250 ℃維持2 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。質(zhì)譜(MS)條件：電子轟擊電離(EI)源，SIM掃描方式，電子能量70 eV。標(biāo)準(zhǔn)品曲線制作：稱取適量的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醚配分別配制成0.01、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、250、500 μg/mL 11個標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度。對標(biāo)準(zhǔn)液的濃度系列分別進(jìn)行GC-MS檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(X)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時進(jìn)行精密度、重復(fù)性、回收率、定量限的考察。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者腸道菌群的alpha(α)多樣性發(fā)生顯著變化：對2組患者腸道菌群測序分析，發(fā)現(xiàn)2組樣本測序OTU超過10 000時趨于平緩，說明測序穩(wěn)定、可靠。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，OTU數(shù)量和菌種數(shù)量，見圖1(封二)均顯著變化，提示結(jié)直腸癌患者腸道菌群α多樣性顯著改變。

2.2 結(jié)直腸癌患者腸道的整體組成發(fā)生顯著變化：對2組患者的β多樣性主坐標(biāo)分析(PCoA)，結(jié)果表明結(jié)直腸癌患者的腸道菌群與健康對照組相比發(fā)生了顯著改變，2組各個樣本之間各自相對聚集，2組之間完全分開，說明結(jié)直腸癌患者的腸道菌群在整體組成上有顯著差異。類似地，通過非度量多維尺度分析(NMDS)發(fā)現(xiàn)，2組樣本距離較遠(yuǎn)，亦證實結(jié)直腸癌患者腸道菌群在組成上差異明顯，見圖2(封二)。韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)健康對照組特有菌為513個，結(jié)直腸癌患者特有菌減少至368個。鑒于總體組成發(fā)生了顯著變化，為明確具體差異菌，本研究進(jìn)一步分析了2組門和屬水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 結(jié)直腸癌患者腸道菌群在門水平上顯著失調(diào)：菌群門水平主要組成菌為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。與健康對照組比較，結(jié)直腸癌組厚壁菌門(Firmicutes)顯著增加(P<0.05)，而變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)顯著降低(P<0.05)，提示結(jié)直腸癌患者腸道菌群在門水平上發(fā)生了顯著改變，其中主要表現(xiàn)為菌厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的顯著變化。

2.4 結(jié)直腸癌患者腸道菌群在屬水平上顯著改變：深入分析屬水平上組成變化，與健康對照組相比，結(jié)直腸癌組顯著增加的有確腸桿菌 (Enterobacteriaceae)、變形菌門(Prevotellaceae)、理研菌(Rikenellaceae)、鏈球菌(Streptococcaceae)、丹參科(Tannerellaceae)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、球菌科(Coriobacteriaceae)、巴內(nèi)塞科(Barnesiellaceae)；顯著減少的菌有紅球菌科(Ruminococcaceae)、拉氏菌科(Lachnospiraceae)，提示結(jié)直腸癌患者腸道菌群在屬水平上發(fā)生了顯著改變(P<0.05)。

2.5 結(jié)直腸癌患者腸道菌群之間關(guān)聯(lián)性分析：進(jìn)一步對2組患者的菌群組成進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)2組間菌群關(guān)聯(lián)性差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3(封二)。

2.6 結(jié)直腸癌患者血漿LPS水平顯著升高:血漿LPS來源于腸道菌群紊亂中的革蘭陰性菌，其介導(dǎo)的慢性低度炎癥與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。檢測結(jié)果表明，與健康對照組相比，結(jié)直腸癌組血漿LPS水平亦顯著升高，提示患者存在內(nèi)毒素血癥(P<0.05)，見圖4(封二)。

2.7 結(jié)直腸癌患者腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFAs顯著改變：腸道菌群重要代謝產(chǎn)物SCFAs參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步采用GC-MS檢測了SCFAs含量，結(jié)果表明與健康對照組相比，結(jié)直腸癌組乙酸、丙酸和丁酸顯著減少(P<0.05)。

3 討論

越來越多的研究表明，腸道菌群在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6-8]。隨著2008年人類微生物組學(xué)計劃(HMP)的順利實施，腸道菌群在健康與疾病中的重要作用得到不斷揭示[9]。研究表明，不同類型腫瘤具有顯著差異的腸道菌群組成，可能與不同腫瘤提供的具體特定菌群定植微環(huán)境有關(guān)[10]。在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中，失調(diào)的腸道菌群通過與腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用而促進(jìn)腫瘤的生長[10]。盡管目前還未發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌特征菌，但已發(fā)現(xiàn)其腸道菌群組成顯著區(qū)別于健康人群?；诓煌貐^(qū)飲食、氣候等因素均會影響腸道菌群組成，本研究通過高通量測序分析了結(jié)直腸癌患者腸道菌群組成變化、其代謝產(chǎn)物SCFAs組成及血漿LPS水平，旨在確定結(jié)直腸癌患者差異的腸道菌及其代謝產(chǎn)物。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者腸道菌群總體組成發(fā)生了顯著變化，體現(xiàn)為豐度增加，發(fā)現(xiàn)368種特異菌，提示結(jié)直腸癌患者腸道菌群存在顯著失調(diào)。進(jìn)一步具體分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上以厚壁菌門、擬桿菌門為主，這與以往結(jié)直腸癌腸道菌群研究結(jié)果一致[11]。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者厚壁菌門顯著增加，而變形菌門和擬桿菌門顯著降低，提示可能存在腸道菌群紊亂。研究表明厚壁菌門在結(jié)直腸癌中是顯著富集的[12]。變形菌門與多種慢性代謝性疾病密切相關(guān)[13]。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門在健康志愿者與腺瘤之間具有顯著差異，提示擬桿菌門水平上的改變可能參與了結(jié)直腸癌及腺瘤的發(fā)生[14]。本研究進(jìn)一步分析了腸道菌群屬水平上的變化，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腸桿菌、變形菌門、理研菌、鏈球菌、丹參科、脫硫弧菌科、球菌科、巴內(nèi)塞科、紅球菌科、拉氏菌科，均發(fā)生了顯著變化，提示在屬水平上結(jié)直腸癌亦存在顯著失衡。研究表明，Lachnospiraceae細(xì)菌基因m3具有潛在的結(jié)直腸癌診斷價值[15]。Streptococcaceae的改變與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)[13]。黑色素瘤患者采用PD-1治療過程中，敏感患者Enterobacteriaceae菌減少[16]。然而，更多菌的確切功能仍需要深入研究證實。

本結(jié)果表明，結(jié)直腸癌患者體內(nèi)差異腸道菌群組成，提示腸道菌群失調(diào)，腸道菌群失調(diào)會使腸道產(chǎn)生過量LPS，后者損傷腸道屏障作用，導(dǎo)致腸道完整性破壞和通透性增加，經(jīng)腸道滲漏LPS異位進(jìn)入血液循環(huán)，引起持續(xù)內(nèi)毒素血癥，引發(fā)炎癥參與的持續(xù)疾病進(jìn)展。以往研究發(fā)現(xiàn)包括CRC在內(nèi)的多種腫瘤中存在顯著升高的血漿LPS水平[17]，這支持本研究結(jié)果，提示結(jié)直腸癌患者存在腸道菌群失調(diào)引發(fā)的內(nèi)毒素血癥。

SCFAs，作為腸道菌群重要代謝產(chǎn)物，在正常生理與疾病狀態(tài)下均發(fā)揮重要作用[18]。越來越多的研究表明，SCFAs廣泛參與腸道能量吸收、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、乙?；碛^遺傳修飾等多種生物學(xué)作用[19]。本研究顯示，結(jié)直腸癌患者SCFAs中的乙酸、丙酸和丁酸顯著減少，這與以往多種慢性病減少的SCFAs結(jié)果一致[19]。SCFAs能夠通過結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)發(fā)揮抑制慢性疾病炎癥的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)SCFAs通過上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)改善慢性低度炎癥反應(yīng)[20]。重要的是，SCFAs主要由擬桿菌等腸道菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生[21]，而本研究也發(fā)現(xiàn)CRC擬桿菌顯著下降，提示可能減少擬桿菌下調(diào)SCFAs參與結(jié)直腸癌腸道菌群失調(diào)。

本研究的不足之處：首先，由于臨床研究中腸道菌群在不同個體之間差異較大，這就需要在寧夏區(qū)域多中心進(jìn)行大樣本量分析證實本研究發(fā)現(xiàn)的差異菌及其代謝產(chǎn)物；其次，需要開展腸道菌群宏基因組分析，以便進(jìn)一步明確差異菌關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能及機(jī)制。