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肉豆蔻提取物改善缺血缺氧大鼠腦損傷的作用機制

2022-04-25 11:43邱新茹宗堪堪崔春愛
醫(yī)學研究生學報 2022年2期
關(guān)鍵詞:磷酸化海馬提取物

邱新茹,宗堪堪,孫 周,崔春愛

0 引 言

血管性癡呆(vascular dementia, VD)是繼阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)第2種癡呆常見類型,屬進行性認知功能減退的神經(jīng)退行性疾病,且因男性較于女性更容易患腦血管疾病,故男性發(fā)病率高于女性[1],可誘發(fā)一系列極具破壞性的腦內(nèi)損傷,最終導致心腦血管疾病綜合征[2],故及早防治至關(guān)重要。

克老素基因作為一種“抗衰老基因”,主要在腎和腦脈絡膜表達,可能對老年高血壓、冠心病及認知功能障礙等衰老相關(guān)性疾病的發(fā)生與發(fā)展有調(diào)節(jié)作用。研究表明,外周給予的α-KL蛋白片段,可通過誘導NMDAR亞基GluN2B的分裂,增強NMDAR依賴性突觸可塑性及其記憶力,證明對人類有治療作用[3]。研究報道,作為藥、食兩用的高大喬木植物Myristica fragrans種仁中的肉豆蔻提取物可通過抑制小膠質(zhì)細胞誘導的神經(jīng)炎癥及慢性缺血缺氧誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡[4-5],改善大腦微環(huán)境的穩(wěn)定及大鼠空間學習和記憶能力[6],但其在VD等血管性認知障礙相關(guān)疾病中的作用機制尚不清楚。本研究探討肉豆蔻提取物對慢性缺血缺氧誘導的抗衰老因子克老素表達及PI3K/Akt相關(guān)蛋白表達的調(diào)控作用,為其防治提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物40只健康雄性Wistar大鼠(230±20)g,由延邊大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號為[SCXK(吉)2017-0003],經(jīng)醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準(批準號:20160302),飼養(yǎng)環(huán)境:自然光線,24 h明暗交替,室溫24~26 ℃,完全隨機法分為對照組、慢性腦低灌注模型組和肉豆蔻提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組。

1.2主要藥物及試劑肉豆蔻提取物(Aladdin, 22888-70-6);大鼠Klotho酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(CUSABIO,CSB-E14958r);兔單克隆抗體Klotho[EPR6856](abcam, ab1813)、兔多克隆抗體PI3K p85(CST, #4292)和磷酸化的PI3K(abcam, ab1826)、兔單克隆抗體AKT(CST, #4691)和磷酸化的AKT(CST, #4060)、p-mTOR(CST, #5536)、兔單克隆抗體FoxO3a(D19A7)和磷酸化的FoxO3a(CST, #12829)、兔單克隆抗體β-actin(CST, #4970)和GAPDH(CST, #5174)。

1.3BCCAo動物模型制備及分組40只健康雄性Wistar大鼠(230±20)g,由延邊大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號為[SCXK(吉)2017-0003]。經(jīng)過1周的適應性飼養(yǎng)后,采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAo)方法,制備慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion, CCH)大鼠模型[7],完全隨機法分為對照組(假手術(shù)組)、模型組和肉豆蔻低、中、高劑量組(2.5、5、10 mg/kg),每組8只。術(shù)后20 d起,對照組與模型組給予同等劑量的等滲鹽水灌胃,各實驗組給予不同濃度的肉豆蔻提取物灌胃,至術(shù)后60 d為止。

1.4神經(jīng)行為學檢測運用Morris水迷宮,檢測各組大鼠逃避潛伏期,以此來比較其空間學習和記憶能力。模型制備第45天,歷時8 d的水中找錄平臺的學習和訓練、每只大鼠每天連續(xù)入水3次(每次間隔為90 s),每次入水訓練時間的限度為90 s,記錄其在90 s內(nèi)找尋水下2 cm處安全平臺的時間,即逃避潛伏期。8 d的游泳訓練中,第2、4、6和8天的第1次訓練為probe測試。因此,本實驗主要分析了第1、3、5、7天的3次逃避潛伏期,觀察其空間學習和記憶能力,期間各組大鼠繼續(xù)每天給予藥物或等滲鹽水灌胃,直到處死。

1.5HE染色法術(shù)后第61天,按照常規(guī)心臟灌流方法,運用預冷的PBS和4%甲醛溶液進行心臟灌流及其前固定,經(jīng)過取腦、多聚甲醛后固定和梯度蔗糖脫水、石蠟包埋和切片、HE染色,顯微鏡下觀察對照組、模型組和高劑量肉豆蔻木酚素(10 mg/kg)干預組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學變化,并在高倍顯微鏡下隨機計數(shù)10個海馬各區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量,進行統(tǒng)計學分析。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法術(shù)后第61天,3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,經(jīng)過斷頭、取腦,分離出海馬組織,按照ELISA試劑盒,采用生物素雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法,檢測大鼠海馬組織中克老素水平。所有樣品,均進行重復分析,樣品檢測值均與標準蛋白質(zhì)的含量標準化。

1.7Western blot方法術(shù)后第61天,大鼠取腦,分離海馬組織,制備各組海馬組織勻漿液,按照本實驗室已成形的免疫印跡方法[6],提取總蛋白,經(jīng)過蛋白定量、蛋白變性、常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等常規(guī)操作。其次,在克老素、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-FoxO3a、β-actin和GAPDH等一抗溶液(1:1000)中孵育振蕩過夜(4 ℃)。

2 結(jié) 果

2.1 肉豆蔻提取物改善缺血后大鼠空間認知功能損害各組實驗動物在游泳速度上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),第3天、第5天、第7天結(jié)果顯示,模型組大鼠較對照組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01);而肉豆蔻干預組大鼠與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);肉豆蔻干預組與模型組大鼠間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

a:游泳速度比較; b:逃避潛伏期

2.2肉豆蔻提取物抑制缺血后大鼠海馬神經(jīng)元損害HE染色結(jié)果顯示,低灌注模型組大鼠海馬CA1、CA2區(qū)錐體細胞及DG區(qū)顆粒細胞神經(jīng)元排列紊亂,神經(jīng)元形態(tài)各異、胞體萎縮、核深染,見圖2a,存活的神經(jīng)元數(shù)量減少,模型組大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元存活率較對照組明顯減少(P<0.01);肉豆蔻干預組與模型組大鼠間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖2b;而經(jīng)肉豆蔻提取物干預組神經(jīng)元形態(tài)變化和結(jié)構(gòu)得到明顯緩解,神經(jīng)元形態(tài)基本與對照組海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)相似,見圖3。

a:神經(jīng)元形態(tài)(HE ×40); b:海馬各區(qū)存活的神經(jīng)數(shù)量比較

圖3 肉豆蔻提取物抑制大鼠海馬神經(jīng)元變性和壞死(HE ×400)

2.3 肉豆蔻提取物增強海馬組織抗衰老因子Klotho水平ELISA和免疫印跡法檢測結(jié)果顯示,模型組大鼠海馬組織中Klotho水平明顯低于對照組(P<0.01);肉豆蔻提取物處理組Klotho水平明顯高于模型組(P<0.05),見圖4。

1:對照組;2:模型組;3:肉豆蔻低劑量組;4:肉豆蔻中劑量組;5:肉豆蔻高劑量組

2.4大鼠海馬組織PI3K/Akt/FoxO3a的表達Western blot實驗結(jié)果顯示,與對照組相比較,PI3K、AKT和FoxO3a的磷酸化水平明顯升高(P<0.01);肉豆蔻提取物可以逆轉(zhuǎn)相關(guān)蛋白磷酸化水平,使其表達降低(P<0.05),明顯抑制了PI3K/Akt/FoxO3a的活化。見圖5,表1。

1:對照組;2:模型組;3:肉豆蔻低劑量組;4:肉豆蔻中劑量組;5:肉豆蔻高劑量組

表 1 肉豆蔻提取物對缺血缺氧誘導的蛋白表達量的影響

3 討 論

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論也認為,通過“未病先防”和“既病防變”的過程,調(diào)理與衰老相伴的腦血管病和神經(jīng)退行性疾病。隨著“老齡化社會”的到來,腦血管病及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病勢頭強勁,趨于年輕化,危害著人們的生命健康及生活質(zhì)量,給社會和醫(yī)療環(huán)境帶來了沉重的負擔和痛苦。因此,有必要針對認知脆弱的老年人以及患有腦血管病的患者施以預防措施,提高“大腦的恢復力”,可能是改善認知功能障礙的一種新的治療策略。衰老細胞在腦內(nèi)不斷累積促進了腦內(nèi)慢性炎癥,耗盡神經(jīng)系統(tǒng)再生能力使神經(jīng)元功能喪失,引起腦灌注不足和破壞血腦屏障完整性,推動了腦功能惡化,海馬作為學習記憶相關(guān)的重要區(qū)域,易受缺血、缺氧的影響,大腦表現(xiàn)出相關(guān)的病理變化,導致神經(jīng)退行性疾病[9-10]。

我國藥典中記載肉豆蔻產(chǎn)于我國兩廣南部、云南、臺灣等區(qū)域,具有溫中澀腸、行氣消食,而主治虛瀉冷痢、脘腹冷痛、食少嘔吐及宿食不消,還當作可食用的佐料,是重要的香料和藥用植物,可通過抑制小膠質(zhì)細胞的激活及神經(jīng)凋亡,改善大鼠空間學習和認知功能[5-6,11]。小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)的免疫細胞,具有一定的吞噬清除能力,其包括M1和M2兩種活化形式,但這兩者作用相反,M1型過度激活會促進腦內(nèi)炎癥和損傷,在神經(jīng)退行性疾病進程中起著關(guān)鍵性作用,M2型則起到神經(jīng)保護作用[12]。研究發(fā)現(xiàn),CCH會引起很多促炎因子(INF-α、IL-1β、IL-6等)的產(chǎn)生,促進了小膠質(zhì)細胞的激活和ROS累積,從而導致神經(jīng)元損傷和神經(jīng)功能障礙[13-15]。

Klotho基因是一種抗衰老基因,其過度表達可延長壽命,增強海馬依賴性學習和記憶功能,是調(diào)節(jié)體內(nèi)多種受體親和力的輔助因子,可防止與衰老相關(guān)的認知功能下降[8],主要在腎、腦脈絡叢和神經(jīng)元中高表達,參與到多種代謝途徑中[16],大腦也可產(chǎn)生分泌型克老素蛋白,發(fā)揮著抗衰老等神經(jīng)保護作用[17]。研究發(fā)現(xiàn),通過慢病毒介導腦內(nèi)Klotho過表達,可以抑制Akt/mTOR通路,使自噬-溶酶體系統(tǒng)激活,從而提高對β-淀粉樣蛋白的清除能力,最終改善神經(jīng)血管單元損害和腦內(nèi)毛細血管功能障礙[18-19]。此外,克老素可以刺激負責鞏固記憶的GluN2B亞基N-甲基-D-天冬氨酸受體升高,增強LTP以改善認知記憶功能,并且抑制胰島素樣生長因子生成和Wnt通路激活起到延緩衰老的作用[20-21]。雖然,外源性的Klotho為大分子蛋白(相對分子質(zhì)量約130 000)不易通過血腦屏障進入腦內(nèi)發(fā)揮其生物學作用,而外源性注入的ɑ-KL蛋白片段可通過誘導NMDAR亞基GluN2B的分裂,增強NMDAR依賴性突觸可塑性及其記憶力[3],故對體內(nèi)內(nèi)源性克老素蛋白含量的調(diào)控意義尤其重要。在本實驗中,肉豆蔻提取物明顯增強了慢性缺血缺氧所誘導的大鼠海馬組織中克老素水平和蛋白表達,與大鼠空間學習和記憶功能的調(diào)控結(jié)果相一致[22]。

炎癥反應是機體對抗感染和損傷做出的自我保護措施,修復組織損傷,防止病原體擴散,PI3K/AKT是促炎介質(zhì)表達的關(guān)鍵性調(diào)控通路。AD模型大鼠的皮層、海馬、隔核等區(qū)域有FoxO3a 免疫陽性物質(zhì)分布,F(xiàn)oxO3a是PI3K/Akt信號通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子,Akt途徑被抑制時,去磷酸化的FoxO3a大部分進入細胞核,調(diào)節(jié)不同的凋亡靶目標,導致細胞凋亡[23]。因此,調(diào)控PI3K/Akt/FoxO3a通路中的關(guān)鍵蛋白,尋找神經(jīng)炎癥的治療靶點,明確其發(fā)病機制,開發(fā)有效藥物成為亟待解決的問題。當Akt/mTOR信號通路異常活化時FoxO3a的磷酸化水平升高;而其升高可抑制細胞凋亡,從而可假設(shè)通過抑制PI3K/Akt/FoxO3a信號網(wǎng)絡中的關(guān)鍵點,調(diào)控小膠質(zhì)細胞的增殖和激活,就可控制神經(jīng)炎癥病變的發(fā)生和發(fā)展,F(xiàn)oxO3a的激活是維持神經(jīng)元存活所必需的。體外研究也表明,可能通過調(diào)節(jié)FoxO3a基因轉(zhuǎn)錄過程,保護小腦顆粒神經(jīng)元免受氧化應激損傷和調(diào)控細胞凋亡[4,24]。本實驗結(jié)果也顯示,肉豆蔻提取物顯著抑制了慢性缺血缺氧誘導的大鼠海馬組織PI3K、Akt、FoxO3a的磷酸化水平,增強了Klotho蛋白的表達,發(fā)揮了明顯的抗衰老、抗炎效力,延緩了大鼠海馬神經(jīng)元細胞的衰老進程,對CCH海馬區(qū)神經(jīng)元衰老與損傷發(fā)揮保護作用。

綜上所述,通過CCH模型大鼠腦組織研究得出肉豆蔻提取物通過抑制PI3K/AKT/FoxO3a信號通路,減少其磷酸化水平,并可增強克老素蛋白的表達和腦組織內(nèi)含量,從而發(fā)揮抑制神經(jīng)元損傷,改善大鼠學習和記憶功能,可能具有預防衰老和神經(jīng)炎癥的治療潛力。

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