徐清瑩， 于佳琨， 邢琳琳， 趙夢(mèng)雅， 劉 軍， 王勝男，劉 賀， 朱力杰,*

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心， 遼寧 錦州 121013；2.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司， 山東 德州 251200)

由蛋白質(zhì)等親水膠體構(gòu)成的乳液是食品工業(yè)中的重要體系之一，乳液的穩(wěn)定性同乳化型食品的感官品質(zhì)密切相關(guān)。在加工過程和貨架期內(nèi)，乳液對(duì)pH值、離子強(qiáng)度、溫度等環(huán)境因素較為敏感，乳液液滴間的相互作用會(huì)導(dǎo)致液滴的團(tuán)聚和絮凝，進(jìn)而引起脂肪層上浮、蛋白質(zhì)沉淀，這些失穩(wěn)現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重影響乳液的口感及外觀品質(zhì)[1]。乳液穩(wěn)定性同液滴、絮凝物的尺度以及油相黏度等因素有關(guān)[2]，此外，環(huán)境因素及蛋白質(zhì)的分子尺寸、分子柔性、表面疏水性等都會(huì)對(duì)乳液穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[3-4]。目前，探究不同環(huán)境因素對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響已成為食品工業(yè)中的一個(gè)重要研究方向。

在食品加工與貯藏過程出現(xiàn)的環(huán)境影響因素中，冷凍貯藏可以保持食品乳化劑的化學(xué)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其貨架期，但凍融循環(huán)后，乳液可能會(huì)失去原來的理想狀態(tài)。凍結(jié)過程中形成的冰晶能夠減少脂滴之間的空間，促進(jìn)界面層的破裂，并可能促進(jìn)脂滴的結(jié)合[5]；另一方面，對(duì)蛋白質(zhì)等乳化劑進(jìn)行酶改性可以顯著提高凍融穩(wěn)定性[6]。在加工過程中采取適當(dāng)?shù)臒崽幚砜梢愿淖兊鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露，使其界面活性增強(qiáng)，理化和功能性質(zhì)得到明顯改善[7-8]。亦有研究表明，酸處理可以提升蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性和起泡性[9-10]；此外，在蛋白體系中添加適量多糖后，可以調(diào)節(jié)pH值，使二者攜帶相反電荷，通過靜電相互作用形成穩(wěn)定性更好的復(fù)合乳液體系[11]。

作為一種低成本的蛋白質(zhì)來源，大豆分離蛋白具有良好的營(yíng)養(yǎng)和理化特性，在食品工業(yè)中被作為乳化劑廣泛應(yīng)用[12-14]。大豆球蛋白(glycinin，11S)是大豆分離蛋白中最為典型的組分之一，分析其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)對(duì)深入研究大豆分離蛋白的加工適應(yīng)性具有重要意義。大豆皂苷(soyasaponin，Ssa)具有兩親性的分子結(jié)構(gòu)以及多種生物活性，良好的界面活性使其在研制復(fù)合乳化劑等領(lǐng)域具有應(yīng)用前景[15-16]。已有研究表明，11S- Ssa體系可以形成較為穩(wěn)定的乳液[14]，但環(huán)境因素對(duì)該乳液體系的影響未見報(bào)道。本研究擬選取11S、Ssa為研究對(duì)象，利用11S- Ssa體系制備復(fù)合乳液，采用多重光散射技術(shù)對(duì)熱及酸化處理乳液的整體穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)經(jīng)過熱、酸化及凍融處理后復(fù)合乳液的粒徑分布、粒徑大小以及絮凝率進(jìn)行表征，研究環(huán)境因素對(duì)復(fù)合乳液穩(wěn)定性的影響，以期為11S- Ssa復(fù)合體系應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆皂苷購(gòu)于西安通澤生物科技有限公司，低溫脫脂豆粕購(gòu)于山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，長(zhǎng)壽花玉米油購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)藥品均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ200- SH型高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；HL- 2000型高壓均質(zhì)機(jī)，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；BT- 9300ST型激光粒徑分布儀，丹東市百特儀器有限公司；MS300型磁力攪拌器、PHS- 3CW型pH計(jì)，上海般特儀器制造有限公司；AR124CN型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；Turbiscan多重光散射分析儀，法國(guó)Formulaction公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.111S球蛋白的制備

采用Xu等[17]的方法從低溫脫脂豆粕中提取11S組分。用粉碎機(jī)將低溫脫脂豆粕粉碎，然后與水按質(zhì)量體積比(g∶mL)為1∶15的比例混合、攪勻后用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.5。將溶液置于45 ℃水浴鍋中低速攪拌1 h，用180目尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液后常溫下離心(6 900 r/min，30 min)，棄去沉淀后在上清液中加入亞硫酸氫鈉(0.98 g/L)，混勻靜置0.5 h后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至6.4。將上述溶液放入冰箱(4 ℃)過夜后4 ℃離心(5 900 r/min，20 min)，在上清液中加入0.25 mol/L NaCl后用2 mol/L HCl調(diào)pH值至5.0，料液靜置1 h后于4 ℃離心(6 900 r/min，30 min)，得到的沉淀即為11S組分。用去離子水將11S組分洗滌兩次后，再次加入10倍體積的去離子水并用2 mol/L NaOH 調(diào)pH值至7.5，充分?jǐn)嚢柚?1S組分完全溶解，置于4 ℃冰箱內(nèi)開始透析48 h以脫去鹽分，冷凍干燥后于25 ℃環(huán)境下保存。

1.3.211S- Ssa復(fù)合體系的制備

將11S球蛋白和Ssa樣品溶解于10 mmoL/L中性磷酸鹽緩沖液中，攪拌2 h(室溫)。為了保證11S的充分水化，將獲得的蛋白分散液放置于冰箱(4 ℃)過夜。將11S和Ssa溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0后進(jìn)行不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的11S- Ssa混合溶液的制備，其中Ssa的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.5%，11S最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為0.5%?；旌先芤豪^續(xù)攪拌30 min(室溫)以確保11S和Ssa間的相互作用充分發(fā)生。

1.3.311S- Ssa復(fù)合乳液的制備

將玉米油與11S- Ssa復(fù)合溶液按照一定比例混合攪拌20 min(室溫)，其中連續(xù)相(水相)為10 mmoL/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)，分散相(油相)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，11S的質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為0.5%，Ssa的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.5%。將混合好的溶液經(jīng)高速剪切機(jī)(8 000 r/min，2 min)處理，初步乳化后得到初級(jí)乳液，再經(jīng)過兩次高壓均質(zhì)處理(50 MPa)得到最終乳液。

1.3.411S- Ssa復(fù)合乳液的熱處理

取20 mL新鮮制備的11S- Ssa復(fù)合乳液置于乳液瓶中，密封好進(jìn)行熱處理。采用水浴方式于90 ℃熱處理20 min，采用高溫蒸汽滅菌方式于120 ℃熱處理20 min。經(jīng)過熱處理后的樣品迅速進(jìn)行冰浴，待其冷卻后立刻測(cè)定指標(biāo)。

1.3.511S- Ssa復(fù)合乳液的酸化處理

取10 mL新鮮制備的11S- Ssa復(fù)合乳液，用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0、4.5、3.0、2.0后立刻測(cè)定指標(biāo)。

1.3.611S- Ssa復(fù)合乳液的凍融處理

取10 mL新鮮制備的11S- Ssa復(fù)合乳液置于具塞試管中，在-20 ℃冷凍儲(chǔ)存22 h后，30 ℃解凍2 h。取部分樣品進(jìn)行測(cè)定，其余樣品重新冷凍，反復(fù)進(jìn)行3次。

1.3.7處理后復(fù)合乳液的粒徑測(cè)定

采用激光粒度分布儀對(duì)乳液油滴的粒徑大小及分布進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)定為：顆粒折射率、吸收率分別為1.467和0.002；波長(zhǎng)為633 nm；分散劑為水，折射率為1.330；測(cè)試溫度為25 ℃。乳液的絮凝率(FD)計(jì)算方法見式(1)[18]。

FD=(d43-d43SDS)/d43SDS×100% 。

(1)

式(1)中，d43為體積平均粒徑，μm；d43SDS為加入SDS所測(cè)得的d43，μm。

1.3.8乳液穩(wěn)定性的測(cè)定

采用多重光散射分析儀對(duì)純11S乳液及11S- Ssa復(fù)合乳液在非破壞且無接觸情況下的整體穩(wěn)定性進(jìn)行分析?；诙嘀毓馍⑸湓韺?duì)乳液樣品進(jìn)行靜置垂直掃描，進(jìn)而提供樣品穩(wěn)定程度信息。準(zhǔn)確吸取經(jīng)過熱處理、酸化處理的乳液樣品20 mL，放入多重光散射專用玻璃測(cè)試瓶中開始進(jìn)行掃描(每隔1 h進(jìn)行一次，持續(xù)24 h)，測(cè)定乳液的穩(wěn)定性。利用Turbiscan軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、計(jì)算出樣品的穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)指數(shù)(turbiscan stability index，TSI)。

2 結(jié)果與分析

2.1 11S- Ssa復(fù)合乳液的熱穩(wěn)定性分析

2.1.1熱處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑分布的影響

為了評(píng)價(jià)熱處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合體系乳化性的影響，研究了熱處理后11S- Ssa復(fù)合乳液穩(wěn)定性的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。圖1中實(shí)物為乳液外觀圖像，可以看到，乳液經(jīng)熱處理后外觀未發(fā)生明顯變化。乳液的粒徑分布與乳液穩(wěn)定性密切相關(guān)，單峰且均一的粒徑分布往往表示較為穩(wěn)定的乳液狀態(tài)。圖1顯示，90 ℃熱處理復(fù)合乳液的粒徑分布出現(xiàn)了明顯的多峰現(xiàn)象，推測(cè)可能由于是乳液經(jīng)熱處理后，吸附于界面上的蛋白質(zhì)和體相溶液中未吸附的蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致乳液液滴粒徑增大；當(dāng)處理溫度增加到120 ℃時(shí)，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～0.50%的Ssa，復(fù)合乳液粒徑分布變?yōu)榫环€(wěn)定的狀態(tài)，這可能是經(jīng)過120 ℃熱處理后的Ssa與吸附在界面上的蛋白發(fā)生相互作用，使蛋白分子展開在界面上發(fā)生構(gòu)象重排，導(dǎo)致乳液粒徑變小。

圖中實(shí)物圖為熱處理后乳液的外觀(從左至右Ssa質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次增大)。圖1 熱處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑分布的影響Fig.1 Effect of heat treatment on particle size distributions of emulsions stabilized 11S- Ssa mixture

2.1.2熱處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小及絮凝率的影響

不同大小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2 熱處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小和絮凝率的影響Fig.2 Effect of heat treatment on particle size and flocculation rate of emulsions stabilized by 11S- Ssa mixture

圖2為熱處理前后復(fù)合乳液的粒徑大小及絮凝率隨Ssa的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化情況。通常情況下，乳液的粒徑大小及絮凝率同穩(wěn)定性呈反比。圖2(a)結(jié)果顯示，25℃時(shí)復(fù)合乳液粒徑隨著Ssa質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加明顯減小，與粒徑分布結(jié)果一致；圖2(b)顯示，絮凝率變化趨勢(shì)與粒徑變化相似。復(fù)合乳液經(jīng)過90 ℃熱處理后，絮凝率顯著上升；當(dāng)溫度升高至120 ℃時(shí)，添加一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.05%～0.50%)的Ssa后，乳液粒徑和絮凝率又出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)。

2.1.3熱處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液TSI值的影響

圖3 熱處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液TSI值的影響Fig.3 Effect of heat treatment on TSI of emulsions stabilized by 11S- Ssa mixture

圖3為11S- Ssa復(fù)合乳液TSI值的變化情況。TSI值越小，乳液越穩(wěn)定。由圖3可見，經(jīng)熱處理后，純11S乳液的TSI值降低，表明熱處理會(huì)影響該乳液的穩(wěn)定性；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的Ssa時(shí)，熱處理后的乳液TSI值變化情況與純11S蛋白乳液相近；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%～0.50%的Ssa時(shí)的復(fù)合乳液，熱處理后TSI值較純11S蛋白乳液有所下降，表明乳液具有良好的熱穩(wěn)定性。90 ℃熱處理性后，3組添加了Ssa的乳液在24 h時(shí)TSI值較為接近，均小于純11S蛋白乳液；120 ℃熱處理后，添加0.50% Ssa的乳液TSI值最小。本研究表明，添加了Ssa的乳液普遍在24 h時(shí)具有更小的TSI值，穩(wěn)定性更好。

2.2 11S- Ssa復(fù)合乳液的酸穩(wěn)定性分析

2.2.1酸處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑分布的影響

對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液進(jìn)行酸化處理后的乳液粒徑分布情況如圖4。由圖4中乳液直觀照片可以看出，乳液對(duì)pH值的變化較為敏感。pH值為7.0時(shí)，復(fù)合乳液都表現(xiàn)了均一、穩(wěn)定的形態(tài)；在pH值 4.5時(shí)靠近了11S等電點(diǎn)，復(fù)合乳液的粒徑分布均出現(xiàn)多峰現(xiàn)象及明顯的相分離，這可以歸因于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近溶解度降低、乳化性變差。進(jìn)一步降低pH值至2.0后，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05% 的Ssa，復(fù)合乳液粒徑分布呈現(xiàn)單峰穩(wěn)定的狀態(tài)。這可能是因?yàn)樗峄幚砗?1S表面巰基含量及表面疏水性顯著增加，導(dǎo)致更多疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)暴露出來，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)部分展開，乳化性增強(qiáng)。

圖中實(shí)物圖為酸化處理后乳液外觀照片(從左至右Ssa質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次增大)。圖4 酸化對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑分布的影響Fig.4 Effect of acidification on particle size distributions of emulsions stabilized 11S- Ssa mixture

2.2.2酸處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小及絮凝率的影響

圖5顯示了酸化處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小和絮凝率的影響情況。由圖5(a)和圖5(b)可以看到，乳液的粒徑以及絮凝率均隨著pH值的降低先增大后減小，在11S等電點(diǎn)(pH值為4.6)附近最大。由圖可清晰看到，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05% 的Ssa導(dǎo)致了復(fù)合乳液粒徑和絮凝率的減小，這與復(fù)合乳液粒徑分布結(jié)果一致(圖4)。

2.2.3酸處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液TSI值的影響

圖6反映了酸處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液TSI值的影響。圖6顯示，在中性條件下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%的Ssa可以提高11S- Ssa復(fù)合乳液的穩(wěn)定性。隨著pH值的降低，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的Ssa時(shí)的復(fù)合乳液穩(wěn)定性有所提高。進(jìn)一步降低pH值至2.0后復(fù)合乳液穩(wěn)定性好轉(zhuǎn)，各組乳液24 h時(shí)的TSI值降至8.5以內(nèi)。結(jié)合粒徑及絮凝率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入0.05%的Ssa可以增強(qiáng)復(fù)合乳液的酸耐受性。

不同大小寫字母表示不同組間差異顯著(P<0.05)。圖5 酸化對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小和絮凝率的影響Fig.5 Effect of acidification on particle size and flocculation rate of emulsions stabilized by 11S- Ssa mixture

圖6 酸處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液TSI值的影響Fig.6 Effect of acidification on TSI of emulsions stabilized by 11S- Ssa mixture

2.3 11S- Ssa復(fù)合乳液的凍融穩(wěn)定性分析

2.3.1凍融處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑分布的影響

11S- Ssa復(fù)合乳液經(jīng)凍融處理后的粒徑分布情況如圖7。由圖7中乳液直觀照片可以看出，經(jīng)過一次凍融循環(huán)后，乳液出現(xiàn)了明顯的乳析現(xiàn)象，再次循環(huán)后，試管上方出現(xiàn)油滴，發(fā)生了破乳現(xiàn)象，說明各組乳液的抗凍融能力均較差。純11S乳液的粒徑分布較添加了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Ssa的復(fù)合乳液更為均一。

2.3.2凍融處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小及絮凝率的影響

凍融處理對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小和絮凝率的影響情況如圖8。圖8顯示，未凍融處理前，純11S蛋白乳液和11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑都小于10 μm；經(jīng)過凍融處理后，11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑增至200 μm以上。隨著凍融次數(shù)的增加，純11S乳液粒徑不斷增大。3次循環(huán)后，11S- Ssa復(fù)合乳液的粒徑[圖8(a)]和絮凝率[圖8(b)]都隨著Ssa質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減小，添加0.50%的Ssa能夠降低凍融后復(fù)合乳液的絮凝率，但各組乳液在凍融處理后的穩(wěn)定性均較差。

圖中實(shí)物圖為凍融處理后乳液外觀照片(從左至右Ssa質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次增大)。圖7 凍融對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑分布的影響Fig.7 Effect of freeze-thaw on particle size distributions of emulsions stabilized 11S- Ssa mixture

不同大小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖8 凍融對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液粒徑大小和絮凝率的影響Fig.8 Effect of freeze-thaw on particle size and flocculation rate of emulsions stabilized by 11S- Ssa mixture

3 結(jié) 論

本研究表明，熱處理對(duì)純11S乳液的穩(wěn)定性影響較大。11S- Ssa復(fù)合乳液經(jīng)熱處理后穩(wěn)定性雖有所降低，但添加Ssa的復(fù)合乳液穩(wěn)定性仍優(yōu)于純11S乳液。11S在等電點(diǎn)附近發(fā)生的絮凝現(xiàn)象對(duì)11S- Ssa復(fù)合乳液的酸耐受性有較大影響。pH值為4.5時(shí)的復(fù)合乳液穩(wěn)定性較差，出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的分層現(xiàn)象，但一旦跨過等電點(diǎn)，進(jìn)一步降低pH值后，乳液的穩(wěn)定性有所改善，Ssa在一定程度上可以提高復(fù)合乳液的酸耐受性。凍融處理嚴(yán)重影響了乳液的穩(wěn)定性，純11S乳液經(jīng)3次凍融循環(huán)后，粒徑和絮凝率均逐漸增大；添加Ssa能降低復(fù)合乳液的粒徑和絮凝率，但如何提高11S- Ssa復(fù)合乳液的凍融穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步研究?？傮w而言，添加0.05%～0.50%的Ssa能夠提高復(fù)合乳液在熱和酸化處理下的穩(wěn)定性，但沒有明顯改善凍融處理后乳液的失穩(wěn)現(xiàn)象。