閆偉， 王玉濤， 張永浩， 劉海霞*， 韓大勇， 朱愛文

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)自治區(qū)重點實驗室，新疆 喀什 844000）

在羊肉產(chǎn)量滿足人們需求的同時，肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）含量高的羊肉更受消費(fèi)者青睞[1-2]。IMF反映了動物肌內(nèi)脂肪沉積能力，目前IMF是評價羊肉質(zhì)性狀的重要指標(biāo)之一，IMF含量的高低直接影響羊肉的風(fēng)味、嫩度、適口性及多汁性[3-4]，決定了羊肉的商品特性和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)收益。為了滿足消費(fèi)者對高質(zhì)量羊肉制品的需求，研究調(diào)控羊肉IMF含量的生物學(xué)機(jī)制逐漸成為近年來的研究熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，動物脂肪沉積部位包括皮下、內(nèi)臟組織周圍、肌肉群之間、肌纖維束間（肌內(nèi)脂肪）和肌纖維內(nèi)脂肪，且不同部位脂肪含量存在差異，皮下和肌間脂肪約占30%，肌內(nèi)脂肪約占1%[5]。動物肌內(nèi)脂肪沉積表現(xiàn)為肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖和肥大[6]，通常肌內(nèi)脂肪細(xì)胞以簇的形式聚集，起初為前體脂肪細(xì)胞增殖，進(jìn)而前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞[7]。目前，山羊、綿羊及多種動物體內(nèi)均能夠分離和培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞，通過前體脂肪細(xì)胞模型開展綿羊脂肪沉積研究具有較大優(yōu)勢。

綿羊脂肪沉積過程受多種基因調(diào)控。大麻素受體 1（cannabinoid receptor 1)基因 CNR1主要表達(dá)于腦、脊髓、脂肪、肌肉和肝臟組織[8-9]，其功能蛋白CB1受體與內(nèi)源性大麻素組成的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endogenows cannabinoid system，ECS）在動物整體能量代謝[10]和脂肪代謝中發(fā)揮核心作用[11-13]。脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4）基因FABP4在脂肪細(xì)胞分化期間高表達(dá)，能夠結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸，在甘油三酯合成和分解中具有重要作用。FABP4基因高表達(dá)有利于長鏈脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[14]及肌肉組織對脂肪酸的吸收[15-16]。本研究前期通過分析采集的17個綿羊半同胞家系生長和胴體數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，綿羊FABP4基因變異與IMF含量等表型性狀顯著相關(guān)[17]，推測FABP4基因變異可能影響FABP4蛋白，進(jìn)而影響綿羊肌內(nèi)脂肪沉積。轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）形成的異源二聚體影響小鼠FABP4基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[18]，且轉(zhuǎn)錄因子c-Jun受細(xì)胞內(nèi)c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠中激活的CB1受體同樣能夠作用于細(xì)胞內(nèi)激酶JNK調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Jun，從而影響細(xì)胞功能[19]，由此表明，CNR1基因與FABP4基因間可能存在互作。

目前，前人主要對羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化基因的表達(dá)開展研究，杜琛等[20-21]和鄭竹清等[22]對絨山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞開展基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄組和LncRNA分析；崔京京等[23]和羅燕等[24]對綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞開展分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化；李戡等[25]對綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）調(diào)控作用開展研究。但關(guān)于調(diào)控綿羊肌內(nèi)脂肪沉積基因表達(dá)的研究非常有限。因此，本研究利用綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，欲揭示CNR1和FABP4基因的表達(dá)特征及差異，為進(jìn)一步研究CNR1和FABP4基因間調(diào)控關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試動物 采購3日齡湖羊羔羊一只，羔羊全身用75%醫(yī)用酒精消毒后屠宰，無菌條件下快速采取羔羊背最長肌組織保存于含100 U雙抗（青霉素和鏈霉素）的無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中備用。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、0.25%的胰蛋白酶、PBS緩沖液和青霉素、鏈霉素購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自北京政博偉業(yè)生物科技有限公司，Ⅱ型膠原酶、胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司，油紅O染液購自北京索萊寶科技有限公司。RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，Light Cycler 480 SYBR Green I Master購自瑞士羅氏公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的分離及傳代培養(yǎng) 3日齡湖羊羔羊背部切取倒數(shù)第2和第3肋骨間背最長肌組織，用含雙抗的PBS沖洗最少3遍后移入超凈工作臺，無菌操作下用外科手術(shù)剪剔除背肌組織肉眼可見的血管和結(jié)締組織，小心分離肌束膜，置于50 mL離心管中用PBS液懸浮，1 500 r·min離心5 min后去除PBS。加入0.2%的Ⅱ型膠原酶在37℃水浴鍋中振蕩消化90 min，加入等體積的消化終止液（10%FBS+DMEM）終止消化，2 500 r·min-1離心10 min后棄上清液。加入2 mL完全培養(yǎng)基（10%FBS+DMEM+雙抗）重懸細(xì)胞，先后利用100和40 μm的無菌細(xì)胞篩過濾細(xì)胞。濾液2 000 r·min-1離心5 min后棄上清，沉淀加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，然后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)2 h后進(jìn)行觀察，見少量細(xì)胞貼壁后即將未貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移接種至新的培養(yǎng)皿。新培養(yǎng)皿中細(xì)胞在培養(yǎng)2.5 h后棄培養(yǎng)液，應(yīng)用新鮮培養(yǎng)液沖洗貼壁細(xì)胞2次后繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換1次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)5～7 d。原代細(xì)胞長到80%～90%豐度時用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔2 d換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞長到80%豐度后繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長曲線測定 原代細(xì)胞鋪滿至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞、經(jīng)PBS洗液洗滌后收集細(xì)胞，按每孔8.0×104CELL等量接種至6孔培養(yǎng)板內(nèi)，隨機(jī)分為8組，每組3孔。將6孔板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此時記作第0天。以后每3 d取3孔細(xì)胞消化，每孔計數(shù)3次，結(jié)果以3孔的細(xì)胞均數(shù)表示。如此至第8組結(jié)束，繪制細(xì)胞生長曲線，橫坐標(biāo)為觀察時間，縱坐標(biāo)為平均細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 前體脂肪細(xì)胞均為第3代細(xì)胞開展誘導(dǎo)分化，細(xì)胞接種密度為3×103CELL·cm-2，細(xì)胞長滿后先換分化培養(yǎng)液（DMEM+10%FBS+1%雙抗+1 μmol·L-1地塞米松+10 mg·L-1胰島素+0.5 mmol·L-1IBMX）培養(yǎng)2 d，再換培養(yǎng)液（DMEM+10%FBS+1%雙抗+10 mg·L-1胰島素）培養(yǎng)2 d，最后換常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d，期間，每2 d換1次液。

1.2.4 肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的油紅O染色 分別于細(xì)胞分化的第4、8和12天棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞3次。用10%甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗2次，油紅O染色40 min，棄去染色液后用蒸餾水漂洗剩余染色液，然后在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測和統(tǒng)計分析 培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞分別在誘導(dǎo)分化后的第2、4、8和12天收集細(xì)胞提取總RNA。細(xì)胞總RNA提取根據(jù)Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取試劑盒說明書進(jìn)行。總RNA去除基因組后，取RNA 1 μL用紫外分光光度計測定OD值（OD260、OD280及 OD260/OD280），計算RNA的純度和含量。取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，開展qRT-PCR分析。3個基因qRT-PCR的擴(kuò)增程序均為：95℃10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量。引物信息詳見表1。

表1 擴(kuò)增引物序列Table 1 Sequences of amplified primers

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的形態(tài)

如圖1所示，經(jīng)胰蛋白酶消化的細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)至第3天時，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞呈梭形、不規(guī)則倒三角形或星形，呈逐漸伸展?fàn)顟B(tài)；細(xì)胞培養(yǎng)至第6天時，細(xì)胞呈長梭形且體積進(jìn)一步增大，伸展?fàn)顟B(tài)更加明顯；細(xì)胞培養(yǎng)至第8天時，逐步呈單層匯合狀態(tài)，少部分細(xì)胞亦可自行分化，但未觀察到脂滴形成。

圖1 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)（200×）Fig.1 Primary cultured cells of intramuscular preadipocyte in sheep（200 ×）

2.2 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的生長曲線

繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果（圖2）表明，生長曲線呈近S型，符合體外細(xì)胞增長規(guī)律。接種至第6天細(xì)胞增長較緩慢，第6至15天進(jìn)入指數(shù)增長期，第15天后逐步進(jìn)入增長平臺期。

圖2 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的生長曲線Fig.2 Growth curve of intramuscular preadipocyte cells in sheep

2.3 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及油紅O染色鑒定

誘導(dǎo)分化劑能夠促使綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞進(jìn)入快速分化階段。如圖3所示，誘導(dǎo)分化第4天，觀察到極少數(shù)細(xì)胞生成小脂滴，生脂細(xì)胞數(shù)量非常有限；誘導(dǎo)分化第8天，生脂細(xì)胞數(shù)量隨著細(xì)胞分化的加快明顯增加，脂滴數(shù)量顯著增多，多個小脂滴逐步匯合后呈串狀；誘導(dǎo)分化第12天，成脂細(xì)胞產(chǎn)生大量脂滴，且脂滴體積增大。油紅O將脂滴染成紅色，說明前體脂肪細(xì)胞已分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

圖3 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（100×）Fig.3 Induced differentiation of intramuscular preadipocyte in sheep（100 ×）

2.4 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞CNR1和FABP4基因表達(dá)規(guī)律及差異

肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞CNR1基因的相對表達(dá)量隨分化時間延長逐漸增加（圖4），其中，第12天的表達(dá)量顯著或極顯著高于第2、4、8天的表達(dá)量；第8天的表達(dá)量顯著高于第2天的表達(dá)量，但與第4天表達(dá)量差異不顯著；第4天表達(dá)量與第2天表達(dá)量差異不顯著。FABP4基因的表達(dá)量也隨分化時間呈逐漸升高趨勢（圖4），其中，第12天的表達(dá)量極顯著高于第2、4、8天的表達(dá)量；第8天的表達(dá)量顯著高于第4天的表達(dá)量，極顯著高于第2天的表達(dá)量；第4天的表達(dá)量與第2天表達(dá)量差異不顯著。比較CNR1和FABP4基因在相同分化時間時的表達(dá)量，結(jié)果（圖5）表明，在第2、4、8天時，CNR1和FABP4基因表達(dá)量差異不顯著；在第12天，F(xiàn)ABP4基因的表達(dá)量顯著高于CNR1基因。

圖4 綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞CNR1和FABP4基因的表達(dá)量Fig.4 CNR1 and FABP4 expression level of intramuscular preadipocyte

圖5 CNR1和FABP4基因的表達(dá)量Fig.5 Difference of CNR1 and FABP4 Expression

3 討論

脂肪組織在動物能量代謝中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織源于動物胚胎中胚層分化的間充質(zhì)干細(xì)胞群，而脂肪干細(xì)胞能夠由間充質(zhì)干細(xì)胞群差異分化形成[26]，且脂肪干細(xì)胞進(jìn)一步分化形成動物前體脂肪細(xì)胞。體外前體脂肪細(xì)胞能夠廣泛開展動物脂肪代謝等研究，是深入揭示動物脂肪沉積分子基礎(chǔ)的首選研究對象。在特定的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件下，前體脂肪細(xì)胞最終分化為成熟的脂肪細(xì)胞，發(fā)揮脂滴合成、脂肪因子分泌和脂質(zhì)儲存等多種功能[27-28]。目前為止，僅從小鼠中分離出成熟的脂肪細(xì)胞系，如3T3-L1、3T3-F442A和ob17等；其他絕大多數(shù)動物只能開展原代分離培養(yǎng)前體脂肪細(xì)胞[23，29-33]，進(jìn)而誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。本研究從湖羊羔羊背最長肌組織中采用差速貼壁法分離原代前體脂肪細(xì)胞，其技術(shù)難度較高，因為新生羔羊背肌組織中可能混有不同的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞等?；诩?xì)胞貼壁時間先后（成纖維細(xì)胞最早貼壁，而前體脂肪細(xì)胞貼壁早于成肌細(xì)胞），首先將細(xì)胞懸液培養(yǎng)2 h，貼壁較快的細(xì)胞最早貼壁，未貼壁細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移接種至新培養(yǎng)皿；新培養(yǎng)皿細(xì)胞培養(yǎng)2.5 h后棄培養(yǎng)液除去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)可獲得純化的前體脂肪細(xì)胞。針對不同動物的前體脂肪細(xì)胞，不同誘導(dǎo)方法的誘導(dǎo)效率存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，油酸法誘導(dǎo)SW872前脂細(xì)胞效率最佳[34-35]；DEX+IN誘導(dǎo)豬前體脂肪細(xì)胞10 d觀察到成熟脂肪細(xì)胞[36-37]；IBMX+DEX+IN誘導(dǎo)山羊背肌前體脂肪細(xì)胞9 d觀察到成熟脂肪細(xì)胞[20]；本研究用IBMX+DEX+IN誘導(dǎo)綿羊背肌前體脂肪細(xì)胞效率低于李戡等[25]結(jié)果，可能是由于二次換液后胰島素誘導(dǎo)劑的作用時間不同。

動物肌內(nèi)脂肪沉積表現(xiàn)為肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖和肥大。目前，前人對綿羊和山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程中多個基因的表達(dá)特征及調(diào)控進(jìn)行了研究，如FTO、LPL、PPARγ、LIPIN、AMPK、C/EBPβ、C/EBPα、SREBP1、AP2 和 Wnt10b[20，25，38]。除肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖分化外，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞肥大也對肌內(nèi)脂肪沉積有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂以谷物為基礎(chǔ)的精飼料后，動物肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的尺寸和大小顯著增加[38-39]，因為精飼料中富含的碳水化合物能夠通過脂肪合成代謝途徑轉(zhuǎn)變?yōu)橹緝Υ嬗诩?nèi)脂肪細(xì)胞，有利于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增大[40]。因此，同時從綿羊采食和能量代謝兩個角度研究肌內(nèi)脂肪沉積對揭示綿羊IMF含量的分子基礎(chǔ)具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，CNR1基因的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)分化呈逐漸升高趨勢，分化后期CNR1基因表達(dá)量顯著高于中前期，說明CNR1基因在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖分化和體積增大中發(fā)揮重要作用。CNR1基因編碼的功能蛋白CB1受體屬于A級G蛋白偶聯(lián)大麻素受體（G-protein-coupled cannabinoid receptor，GPCR），該蛋白在下丘腦、脂肪和肌肉組織廣泛分布[8，41]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織分泌的內(nèi)源性大麻素激活下丘腦CNR1基因高表達(dá)有利于增加小鼠食欲和食量[42]，且其在脂肪組織中激活CNR1高表達(dá)有利于刺激脂肪生成[43]，因此，推測綿羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞CNR1高表達(dá)有利于肌內(nèi)脂肪沉積。FABP4基因在細(xì)胞內(nèi)主要結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸，研究證實，綿羊FABP4基因變異顯著影響肌內(nèi)脂肪沉積[44-47]。本研究發(fā)現(xiàn)，綿羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞FABP4基因同樣隨誘導(dǎo)分化時間的延長呈逐漸升高趨勢，分化后期FABP4基因表達(dá)量顯著高于中前期，與前人研究結(jié)果相一致[48]。研究表明，脂肪細(xì)胞分化過程中FABP4基因轉(zhuǎn)錄受多種因素調(diào)控，如脂肪酸、胰島素及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）[49]，推測綿羊生長過程中過多吸收脂肪酸引起FABP4基因高表達(dá)，從而促進(jìn)肌內(nèi)脂肪沉積。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞分化后期CNR1表達(dá)量顯著低于FABP4基因表達(dá)量，說明CNR1和FABP4基因可能在綿羊肌內(nèi)脂肪沉積中發(fā)揮不同作用。動物脂肪組織過量分泌內(nèi)源性大麻素會負(fù)向調(diào)控動物食欲[50]，表明綿羊體內(nèi)內(nèi)源性大麻素水平可能影響肌內(nèi)脂肪組織CNR1和FABP4基因表達(dá)，進(jìn)而影響肌內(nèi)脂肪沉積。報道發(fā)現(xiàn)，小鼠CNR1基因調(diào)控ACC-1和FASN基因高表達(dá)引起小鼠肥胖[12]，因此，進(jìn)一步研究綿羊CNR1基因與FABP4基因調(diào)控關(guān)系有助于更深入理解肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制。