張桂安，羅勇，董衛(wèi)民，陳清標，鐘惟德

（1.華南理工大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510180；2.佛山市第二人民醫(yī)院泌尿外科，廣東佛山528000；3.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510799）

腎細胞癌是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，其中70%以上的腎細胞癌都是腎透明細胞癌[1]。當前腎透明細胞癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，然而腎透明細胞癌患者的臨床表現(xiàn)通常并不典型，通過影像學和病理學確診時，多數(shù)患者已進入疾病晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，預后并不理想[2?3]。因此，臨床醫(yī)師通過尋找到特異性高和敏感度強的生物標志物來診斷腎透明細胞癌，從而為患者提供最佳的個體化治療方案，既可以避免患者高昂的醫(yī)療費用，又可以客觀評估腫瘤的預后。

甲硫氨酸亞砜還原酶A（methionine sulfoxide reductase A，MsrA）是與抗氧化應激和維持蛋白穩(wěn)定關系密切的一種抗氧化酶。研究表明MsrA 的過表達增強了對氧化應激的抵抗力，而MsrA空突變體對氧化應激表現(xiàn)得更敏感，并且氧化損傷是衰老的關鍵因素，MsrA能夠維持蛋白穩(wěn)定延緩衰老[4]。MsrA可能通過調(diào)控靶蛋白的功能和表達，參與活性氧介導的信號轉(zhuǎn)導。MsrA在結(jié)直腸癌、胃癌和肝癌等多種腫瘤中表達更低，能下調(diào)腫瘤活性[5?7]。但MsrA在腎透明細胞癌中的作用還沒有相關文章報道。本課題擬研究TCGA 數(shù)據(jù)庫和收集臨床樣本中的MsrA在腎透明細胞癌及其癌旁組織中的表達差異，通過分析MsrA 與臨床數(shù)據(jù)特征和臨床預后之間的關系，最后采用列線圖來構建預測腎透明細胞癌患者的生存預后模型，從而為個體化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究收集了佛山市第二人民醫(yī)院5對腎透明細胞癌和癌旁組織標本，所有病例均為接受腎癌切除術，術前未行放射治療或化學治療。樣本都由病理科醫(yī)師通過HE染色明確診斷。

1.2 數(shù)據(jù)下載

從TIMER 數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org/）下載MsrA 在泛癌中表達情況。從GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer?pku.cn/index.html）中下載得到MsrA 在腎透明細胞癌及其對照癌旁組織的差異表達情況。最后從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載TCGA?KIRC 基因表達及其臨床信息數(shù)據(jù)，在基因表達數(shù)據(jù)集中提取出MsrA mRNA 表達數(shù)據(jù)及其相對應的臨床數(shù)據(jù)特征資料，包括年齡、性別、分級、臨床分期、生存時間和生存狀態(tài)。同時將表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)資料進行匹配，排除表達數(shù)據(jù)和臨床信息不全的樣本，最終得到526 例腎透明細胞癌組織和72 例癌旁組織進行后續(xù)的分析。

1.3 免疫組織化學染色

根據(jù)邁新試劑盒（貨號：KIT?9730）說明采用免疫組織化學染色檢測MsrA 在腎組織標本中的蛋白表達水平。60 ℃烘烤切片1 h后在二甲苯和不同酒精濃度梯度中進行脫蠟，之后使用枸櫞酸抗原修復液進行修復。過氧化酶阻斷溶液室溫孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再以非免疫性動物血清室溫封閉30 min。一抗MsrA（1∶200，武漢Proteintech，貨號：14547?1?AP）孵育過夜后予生物素標記的第二抗體室溫孵育20 min，隨后孵育鏈霉菌抗生物素?過氧化物酶溶液。15 min 后進行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染細胞核。免疫組化評分由2 位病理科醫(yī)師獨立確定，評分方法：以鏡下陽性細胞百分比和染色強度評分。計算陽性染色細胞百分率，分為0（0～5%）、1（6%～25%）、2（26%～50%）、3（51%～75%）、4（76%～100%）。染色強度分為0（陰性）、1（弱）、2（中等）、3（強）。免疫組化評分由染色百分率與染色強度評分相乘確定。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用R 4.1.1 和GraphPad Prism8 分析處理數(shù)據(jù)和繪制作圖。配對樣本中的表達量采用配對t檢驗，Wilcoxon秩和檢驗和Kruskal?Wallis檢驗分別用于比較兩組間和兩組以上之間的非配對數(shù)據(jù)。生存曲線采用Kaplan?Meier 檢驗繪制，森林圖用于繪制單因素和多因素Cox 回歸分析，列線圖用于預測患者的生存預后。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MsrA 在腎透明細胞癌和癌旁組織中的表達情況

從TIMER 數(shù)據(jù)庫中下載MsrA 表達的泛癌數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MsrA 在腎透明細胞癌組織中的mRNA 表達水平低于癌旁組織（見圖1A），這一結(jié)果在GEPIA數(shù)據(jù)庫中得到了驗證（P＜0.05，見圖1B）。結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫，在72 對腎透明細胞癌配對樣本中，發(fā)現(xiàn)癌旁組織的表達高于腫瘤組織（P＜0.01，見圖1C）。在免疫組織化學染色中，MsrA 陽性染色為棕黃色，在腎癌旁和腎透明細胞癌組織中主要表達在腎小管上皮的胞質(zhì)內(nèi)（見圖1D，E），兩組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖1F）。

圖1 MsrA在腎透明細胞癌和癌旁組織中的表達差異Figure 1 Differential expression of MsrA in renal clear cell carcinoma and adjacent tissues

2.2 MsrA 表達與腎透明細胞癌臨床數(shù)據(jù)特征的關系

在TCGA 數(shù)據(jù)庫中，以MsrA mRNA 表達量中位數(shù)將MsrA 分為高表達組和低表達組，熱圖結(jié)果顯示性別、臨床分期的T分期和生存狀態(tài)在MsrA高低兩組中存在明顯差異（見圖2A）。為研究MsrA mRNA 表達量在不同臨床數(shù)據(jù)特征條件下是否存在差異，本研究發(fā)現(xiàn)MsrA 的mRNA 表達量在女性中表達更高，隨著分級和臨床分期的增加，MsrA mRNA 表達量反而下降，而且在存活患者中的表達量更高（見圖2B）。

圖2 MsrA mRNA表達與腎透明細胞癌臨床數(shù)據(jù)特征的關系Figure 2 Relationship between MsrA mRNA expression and clinical data characteristics of renal clear cell carcinoma

2.3 MsrA表達與腎透明細胞癌患者預后的關系

利用Kaplan?Meier 生存曲線分析發(fā)現(xiàn)高MsrA mRNA 表達組的腎透明細胞癌患者總體生存率更高（P＜0.001，見圖3A）。單因素和多因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)MsrA mRNA 表達水平、年齡、分級和臨床分期均是腎透明細胞癌患者總體生存率的影響因素，MsrA mRNA 高表達是腎透明細胞癌患者獨立預后指標（見圖3B、C）。

圖3 MsrA表達與腎透明細胞癌患者預后的關系Figure 3 Relationship between MsrA expression and prognosis of patients with renal clear cell carcinoma

2.4 列線圖預測模型構建

將多因素Cox回歸有意義的臨床變量納入預測模型來繪制列線圖。單個臨床變量的不同賦值對應不同得分，將所有臨床變量得分相加為總分，根據(jù)對應的總分即可找出該患者1、2 和3 年生存率（見圖4A）。本研究同時構建了列線圖預后模型校準圖（見圖4B），結(jié)果顯示該模型實際觀測的1、2、3年總體生存與參考曲線較為接近，表明該模型預測性能較強。

圖4 列線圖預測模型Figure 4 Nomogram prediction model

3 討論

腎透明細胞癌是腎細胞癌中最常見的病理類型，而且也是發(fā)病率、死亡率、轉(zhuǎn)移率最高的組織類型。雖然手術治療和分子靶向藥物治療提高了腎透明細胞癌的生存預后，但目前仍缺乏對腎透明細胞癌患者診斷和預后的評估指標，尋找特異性高和敏感度強的診斷生物標志物，將對腎透明細胞癌患者針對性的個體化治療治療和預測預后有重要意義[8?9]。

MsrA 是細胞內(nèi)能清除活性氧的一種重要抗氧化酶，該基因位于8p22?8p23 區(qū)帶。在多種腫瘤發(fā)現(xiàn)MsrA基因高頻缺失，該基因失活將導致機體內(nèi)的活性氧清除障礙，而活性氧清除障礙在幾乎所有腫瘤中都能觀察到，并且活性氧在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的生物學過程中起著關鍵作用[10]。胃黏膜感染幽門螺旋桿菌后會刺激中性粒細胞過度釋放活性氧而出現(xiàn)持續(xù)的氧化應激和慢性免疫反應，最終導致DNA 損傷進展成胃癌[11]。MsrA 表達下降會使活性氧水平升高，PTEN下調(diào)，VEGF上調(diào)，以及磷酸肌醇3?激酶通路的激活，從而導致細胞增殖和細胞外基質(zhì)降解的增加，促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)靶向腫瘤細胞和腫瘤基質(zhì)細胞線粒體內(nèi)的過氧化氫酶可抑制活性氧驅(qū)動的腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[12]。因此增加線粒體的抗氧化能力可成為抗腫瘤治療的一個合理方法。MsrA 在防止氧化應激和增強氧化應激的抵抗力方面具有關鍵作用，保護細胞免受傷害。有研究表明，MsrA 可以保護腎臟細胞免受抗腫瘤化療藥物順鉑誘導的氧化應激、線粒體損傷和細胞凋亡的影響[13]。此外，MsrA可以通過減少氧化應激和炎癥反應從而保護腎臟免受缺血?再灌注損傷[14]。腎透明細胞癌的生長依賴于外源性的谷氨酰胺并展現(xiàn)出谷氨酰胺代謝重編程，而谷氨酰胺代謝途徑能夠提高腎透明細胞癌的抗氧化能力，從而抑制氧化應激[15]。在體外的動物實驗表明，與鄰近的正常和對側(cè)的正常腎組織相比，腎透明細胞癌異種移植腫瘤表現(xiàn)出更高的氧化應激水平[16]。因此，MsrA 可能通過影響氧化應激從而影響腎透明細胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程，這可能成為一種治療腎透明細胞癌的新靶點。

本研究中，與腎癌旁組織相比，MsrA 在腎透明細胞癌組織的表達水平較低，這表明MsrA 可能通過下調(diào)抗氧化酶的活性，使活性氧水平上升，促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外MsrA 表達水平在男性較低，且隨著分級和臨床分期的增加反而下降，這說明MsrA 可能作為抑癌因子，其表達與腎透明細胞癌的惡性程度呈負相關。通過生存曲線發(fā)現(xiàn)MsrA高表達組患者的生存率更高，單因素和多因素Cox回歸分析也表明MsrA mRNA 高表達是腎透明細胞癌患者良好預后的獨立預后指標。本研究也構建一個新的預測模型并且具有相對較強的預測性能，通過列線圖來預測腎透明細胞癌患者的生存預后以提供更好的個性化治療方案。

綜上所述，MsrA 在腎透明細胞癌中的表達減少，與正常腎臟組織的表達水平有顯著差異。MsrA表達水平與腎透明細胞癌的臨床病理特征和預后有關，MsrA 低表達是腎透明細胞癌不良預后的獨立危險因素。對MsrA 的研究為今后腎透明細胞癌的腫瘤分子靶向藥物的研發(fā)和科學治療起到積極的推動作用。