李景上，章嘯君，陳勝昌，蔣錦華，項(xiàng) 云，屠平光，樓芳芳，楊 華，肖英平，*

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 金華 321017； 4.金華市金東區(qū)動(dòng)物防疫檢疫站，浙江 金華 321015)

金華豬是分布于浙江中部的著名地方優(yōu)良品種，與瘦肉型外來(lái)品種豬相比，具有體脂沉積能力強(qiáng)、瘦肉率低等特征；因此，金華豬的氨基酸代謝和肌肉生長(zhǎng)發(fā)育特征可能不同于外來(lái)品種豬。但是，目前關(guān)于金華豬等中國(guó)地方品種豬的氨基酸譜和肌肉發(fā)育性變化的知識(shí)并不豐富，對(duì)二者的相關(guān)性也不清楚。為此，本試驗(yàn)選擇不同生長(zhǎng)階段的金華豬，探究其血清游離氨基酸譜和肌肉水解氨基酸譜的發(fā)育性變化，通過(guò)分析其與肌肉生長(zhǎng)的相關(guān)性，以期為揭示氨基酸在調(diào)控豬肌肉生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的潛在作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

在金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)豬場(chǎng)選擇相同批次的60頭金華豬仔豬進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由采食、飲水。分別于日齡45 d(保育階段)、90 d(生長(zhǎng)階段)、150 d(育肥階段)和270 d(商品豬階段)各隨機(jī)選擇4頭金華豬進(jìn)行采樣。參照Xiao等的血清樣品采集方法，采樣前禁食12 h，從前腔靜脈采集血液樣本，于4 ℃、3 000×離心10 min獲得血清樣品，-80 ℃保存，用于游離氨基酸及其衍生物的測(cè)定；參照朱曉艷等的方法，取左側(cè)胴體倒數(shù)第三到第四腰椎處背最長(zhǎng)肌樣品，液氮速凍后，-20 ℃冰箱保存，用于肌肉水解氨基酸的測(cè)定。

1.2 眼肌面積測(cè)定

選定胸腰椎結(jié)合處背最長(zhǎng)肌橫截面，參照程娜等的方法，測(cè)定并計(jì)算眼肌面積。

1.3 水解氨基酸測(cè)定

背最長(zhǎng)肌樣品解凍后，參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行前處理，用日立L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀(日本Hitachi)測(cè)定肌肉中的水解氨基酸含量。

1.4 血清中的游離氨基酸及其衍生物測(cè)定

參照肖英平等的方法測(cè)定血清中的游離氨基酸及其衍生物濃度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平選定為α=0.05。利用R-studio軟件開(kāi)展主成分分析(PCA)，探尋不同生長(zhǎng)階段肌肉水解氨基酸和血清游離氨基酸及其衍生物的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 眼肌面積的發(fā)育性變化

隨著日齡增加，金華豬眼肌面積顯著(<0.05)增大，在45、90、150、270日齡時(shí)，金華豬的平均眼肌面積分別為(11.15±0.93)、(22.75±1.18)、(26.71±1.16)、(30.54±0.44)cm(圖1)。

2.2 背最長(zhǎng)肌氨基酸的發(fā)育性變化

在9種必需氨基酸中：在45日齡至90日齡，金華豬背最長(zhǎng)肌的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸含量顯著(<0.05)升高(表1)，增幅分別為23.89%、21.90%、19.89%、80.50%、18.56%；在90日齡至150日齡，組氨酸與精氨酸含量顯著(<0.05)降低，降幅分別為45.61%、24.18%；在150日齡至270日齡，組氨酸、精氨酸、纈氨酸、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為41.94%、46.55%、16.28%、19.44%、23.00%，而甲硫氨酸含量顯著(<0.05)降低，降幅為82.17%。在非必需氨基酸中：在45日齡至90日齡，金華豬背最長(zhǎng)肌的天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為20.48%、19.89%、18.89%、19.59%、14.92%、32.73%；在90日齡至150日齡，天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸含量顯著(<0.05)降低，降幅分別為12.65%、12.15%、9.09%、21.92%；在150日齡至270日齡，天冬氨酸、絲氨酸、酪氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為14.03%、12.77%、19.30%。總的來(lái)看，從45日齡到270日齡，必需氨基酸和總氨基酸的含量先升高后降低，在90日齡階段含量最高，顯著(<0.05)高于其他時(shí)段；而非必需氨基酸的含量先升高后降低然后又升高。

柱上無(wú)相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。Bars marked without the same letters indicated significant difference within treatments at P<0.05.圖1 不同生長(zhǎng)階段金華豬的眼肌面積Fig.1 Ribeye areas of Jinhua pig at different growth stages

PCA分析結(jié)果(圖2)顯示，不同日齡金華豬背最長(zhǎng)肌的水解氨基酸譜差異明顯，可直接聚為不同的類(lèi)別。

2.3 不同生長(zhǎng)階段金華豬血清游離氨基酸及其衍生物的發(fā)育性變化

在9種必需氨基酸中：在45日齡至90日齡，金華豬血清的各必需氨基酸含量均無(wú)顯著變化(表2)；在90日齡至150日齡，纈氨酸、亮氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為39.98%、18.87%；在150日齡至270日齡，纈氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為32.45%、20.33%、32.89%。在非必需氨基酸中：在45日齡至90日齡，金華豬血清的谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸含量顯著(<0.05)降低，降幅分別為30.83%、45.13%、37.73%；在90日齡至150日齡，甘氨酸、酪氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為53.81%、13.94%；在150日齡至270日齡，天冬氨酸、谷氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為97.75%、59.11%，而脯氨酸含量顯著(<0.05)降低，降幅為31.90%?？偟膩?lái)看，從45日齡到270日齡，必需氨基酸含量在45日齡到150日齡無(wú)顯著變化，之后顯著上升；非必需氨基酸含量在45日齡到150日齡先顯著(<0.05)降低后顯著(<0.05)升高，從150日齡到270日齡無(wú)顯著變化；總氨基酸含量先顯著(<0.05)降低，至90日齡達(dá)最低值，之后顯著(<0.05)升高。

表1 不同生長(zhǎng)階段金華豬背最長(zhǎng)肌氨基酸的發(fā)育性變化

D45、D90、D150、D270分別表示45日齡、90日齡、150日齡、270日齡。下同。D45， D90， D150， D270 indicates 45， 90， 150， 270 days of age. The same as below.圖2 不同生長(zhǎng)階段金華豬背最長(zhǎng)肌氨基酸主成分分析得分圖Fig.2 PCA score chart of amino acids in longissimus dorsi of Jinhua pigs at different growth stages

在45日齡至90日齡，金華豬血清的鳥(niǎo)氨酸、羥脯氨酸、1-甲基組氨酸、磷酸絲氨酸含量顯著(<0.05)下降(表3)，降幅分別為32.84%、32.75%、32.24%、25.37%，尿素含量顯著(<0.05)升高，增幅為83.97%；在90日齡至150日齡，瓜氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅為40.53%，-丙氨酸含量顯著(<0.05)下降，降幅為36.31%；在150日齡至270日齡，?；撬?、乙醇胺、3-甲基組氨酸、磷酸絲氨酸含量顯著(<0.05)升高，增幅分別為44.27%、30.29%、38.33%、103.87%，-氨基正丁酸、羥脯氨酸、1-甲基組氨酸含量顯著(<0.05)下降，降幅分別為90.00%、44.40%、66.38%。

表2 不同生長(zhǎng)階段金華豬血清游離氨基酸的發(fā)育性變化

表3 不同生長(zhǎng)階段金華豬血清氨基酸衍生物的發(fā)育性變化

PCA分析結(jié)果(圖3)顯示，不同日齡金華豬血清中的游離氨基酸及其衍生物差異明顯，可直接聚為不同的類(lèi)別。

圖3 不同生長(zhǎng)階段金華豬血清中游離氨基酸及其衍生物的主成分分析得分圖Fig.3 PCA score chart of serum free amino acids and their derivatives of Jinhua pigs at different growth stages

2.4 氨基酸與眼肌面積的相關(guān)性

將金華豬眼肌面積分別與肌肉水解氨基酸、血清游離氨基酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析(圖4)，結(jié)果顯示：肌肉和血清中的精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸含量均與眼肌面積呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)在0.03～0.84)，肌肉中纈氨酸含量與眼肌面積的相關(guān)系數(shù)最高(0.69)，血清中精氨酸含量與眼肌面積的相關(guān)系數(shù)最高(0.84)。

圖4 不同生長(zhǎng)階段金華豬肌肉氨基酸、血清氨基酸含量與眼肌面積的相關(guān)性Fig.4 Correlation analysis of muscle amino acids， serum amino acids and ribeye areas of Jinhua pigs at different growth stages

3 討論

肌肉是參與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要組織，主要由水(約占75%)、蛋白質(zhì)(約占20%)和無(wú)機(jī)鹽、礦物質(zhì)、脂肪與碳水化合物等(合計(jì)約占5%)組成。根據(jù)豬的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，在生長(zhǎng)早期，肌肉快速增長(zhǎng)，而在后期，肌肉的生長(zhǎng)速度降低。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，金華豬的眼肌面積隨著日齡的增加而顯著增大，這與前人研究結(jié)果相似。氨基酸作為機(jī)體代謝和神經(jīng)傳遞中重要的小分子物質(zhì)，在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，氨基酸也可在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)合成其他活性物質(zhì)，如激素、小分子含氮物質(zhì)等，參與生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。蛋白質(zhì)是肌肉的重要組成成分，而氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位，由此可推知，肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育應(yīng)與氨基酸的代謝密切相關(guān)。在本研究中，PCA分析的結(jié)果直觀顯示，在不同生長(zhǎng)階段，金華豬肌肉和血清中的氨基酸具有顯著的聚類(lèi)差異，這表明，不同生長(zhǎng)階段金華豬的氨基酸代謝存在明顯差異。本研究中，金華豬肌肉中的水解氨基酸總含量呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，在90日齡達(dá)到最大值；而血清中的游離總氨基酸含量呈現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢(shì)，在270日齡達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)?，豬血清中的游離氨基酸會(huì)進(jìn)入到肌肉中沉積，因此金華豬90日齡階段血清中的游離氨基酸含量降低，而同期的肌肉氨基酸含量顯著升高。布麗君等發(fā)現(xiàn)，榮昌豬從出生到50日齡，精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量增幅最大，但在150日齡之后含量逐漸降低，這與本文試驗(yàn)結(jié)果有相似之處。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，肌肉中甲硫氨酸的含量在45日齡至150日齡階段顯著高于270日齡階段。高水平的甲硫氨酸可促進(jìn)胰島素樣生長(zhǎng)因子(1)表達(dá)，刺激雷帕霉素靶()信號(hào)通路，降低肌肉生長(zhǎng)抑制素(the myostatin-Smad 2/3)表達(dá)，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)；到了豬生長(zhǎng)后期，肌肉生長(zhǎng)減緩，相應(yīng)地，甲硫氨酸的含量也降低。纈氨酸是人類(lèi)和動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的平衡調(diào)節(jié)中起著重要的作用。纈氨酸含量增加，導(dǎo)致氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和肌肉蛋白的合成升高。本試驗(yàn)中，纈氨酸與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育表現(xiàn)出高度正相關(guān)性，與Zhang等和Duan等的結(jié)果一致。Volpi等使用環(huán)-H苯丙氨酸輸注股動(dòng)脈和導(dǎo)靜脈，在基礎(chǔ)狀態(tài)和氨基酸輸注期間測(cè)量肌肉蛋白質(zhì)代謝，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸是影響肌肉合成代謝的一個(gè)重要因素。這與本試驗(yàn)中苯丙氨酸與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的結(jié)果一致。

血液中的氨基酸多被用來(lái)評(píng)估動(dòng)物生理狀態(tài)和機(jī)體的氨基酸需要量。Escobar等提出，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和-1代謝途徑可用來(lái)調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)的氨基酸代謝。精氨酸在哺乳動(dòng)物中被歸類(lèi)為半必需或條件必需氨基酸。Chen等在21日齡仔豬(長(zhǎng)白×約克夏)上的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸通過(guò)Akirin2和AMP-activated蛋白激酶()信號(hào)通路，在肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中促進(jìn)肌球蛋白重鏈的表達(dá)。本文中，血清中的游離精氨酸含量與眼肌面積高度相關(guān)，但其是否與上述信號(hào)通路相關(guān)，還值得進(jìn)一步探究。亮氨酸是調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)中代謝途徑的中間體。Yin等發(fā)現(xiàn)，向日糧中添加0.55%的亮氨酸，通過(guò)誘導(dǎo)核糖體蛋白S6激酶1和4結(jié)合蛋白活化，可促進(jìn)仔豬背最長(zhǎng)肌的蛋白合成。本研究中，血清中的亮氨酸含量呈現(xiàn)出先降低后增高的變化趨勢(shì)，可能是肌肉在生長(zhǎng)過(guò)程中，利用血清中的亮氨酸進(jìn)行蛋白質(zhì)合成代謝，導(dǎo)致45日齡至90日齡階段血清中的亮氨酸含量降低。