★ 孟巖 李焐儀 單家明 陳海芳 黃小英 楊明 楊武亮（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

小承氣湯出自于張仲景的《傷寒論》，由大黃、厚樸、枳實(shí)三者組成［1］，具有輕下熱結(jié)，除滿消痞之效，常用于陽明腑實(shí)輕證。方中君藥大黃源于蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.exBalf.）或藥用大黃（Rheum oきcinaleBaill.）的干燥根和根莖，是我國(guó)常用大宗中藥，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等功效［2］，臨床上主要用于消化系統(tǒng)、急腹癥、免疫系統(tǒng)等疾病的治療［3］?！毒霸廊珪分性疲骸叭藚?、熟地、附子、大黃為藥中之四維……大黃者亂世之良將也”［4］。作為“藥中將軍”，大黃歷來為醫(yī)學(xué)名家所推崇，自《金匱玉涵經(jīng)》以后的本草醫(yī)籍大多可見關(guān)于大黃不同炮制品應(yīng)用的記載［5］。據(jù)陳嘉倩等［6］統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，現(xiàn)存含有大黃的古方共有7 226 首，其中不乏功效顯著的經(jīng)典名方，包括小承氣湯在內(nèi)，目前已有5 首被錄入《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》［7］。

經(jīng)典名方由于具有應(yīng)用廣泛，療效確切等顯著優(yōu)勢(shì)，當(dāng)下已成為中藥研發(fā)的熱點(diǎn)。質(zhì)量是中藥的生命線，為生產(chǎn)出質(zhì)量均一穩(wěn)定的經(jīng)方制劑，首先需要確保藥材及飲片資源質(zhì)量及供給的穩(wěn)定性［8］。作為典型的多產(chǎn)區(qū)藥材，大黃在甘肅、青海、云南及四川等地均有分布，由于受地域、環(huán)境、氣候等因素的影響，各產(chǎn)區(qū)的大黃藥材化學(xué)成分的組成及含量均有一定差異［9-10］，導(dǎo)致藥材質(zhì)量參差不齊，不同品種及不同來源的藥材之間是否可以等質(zhì)替換還有待考證。傳統(tǒng)性狀鑒別及理化鑒別方法均有一定局限性［11］，難以準(zhǔn)確反應(yīng)藥材之間的內(nèi)在質(zhì)量差異，因此，需要建立一種科學(xué)合理的鑒別方法，對(duì)不同產(chǎn)地的大黃藥材進(jìn)行區(qū)分?，F(xiàn)代研究表明，大黃中主要含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、鞣質(zhì)類等化學(xué)成分［12］，具有瀉下、抗病毒、抗炎等藥理作用［13］，其中發(fā)揮瀉下作用的主要活性成分為結(jié)合蒽醌類，游離蒽醌主要作用為抗菌消炎［14-15］。本研究采用HPLC 法測(cè)定大黃藥材中8 種結(jié)合蒽醌和5 種游離蒽醌活性成分的含量，采用2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（V2.0，國(guó)家藥典委員會(huì)）對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并運(yùn)用SPSS 21 軟件對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，以期探明不同產(chǎn)地大黃藥材內(nèi)在活性成分含量差異，為大黃藥材產(chǎn)地的準(zhǔn)確區(qū)分和資源的合理利用提供依據(jù)，同時(shí)為經(jīng)典名方小承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)研究提供合格的藥材與飲片。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD 檢測(cè)器和色譜工作站）；萬分之一電子天平（型號(hào)：BT 224 S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（型號(hào)：BT 25 S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

蘆薈大黃素（批號(hào)：110722-201815）、大黃酸（批號(hào)：110721-201818）、大黃素（批號(hào)：111857-201703）、大黃酚（批號(hào)：110796-201621）、大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201616）、掌葉大黃對(duì)照藥材（批號(hào)：121249-201304）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；蘆薈大黃素-8-O-β-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1497）、蘆薈大黃素-3-（羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1495）、大黃酸-8-O-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1697）、大黃酚-1-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1506）、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1507）、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1508）、大黃素甲醚-1-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1524）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號(hào)：PS1521）均購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司，含量HPLC 歸一化均為98%；甲醇（色譜純），水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。大黃藥材由江西仁和藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)賴學(xué)文教授鑒定。見表1。

表1 樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃藥材供試品溶液的制備

取大黃藥材粉末（過4 號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL 并稱重，水浴回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm 膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 混合對(duì)照品的制備

分別稱取減壓干燥至恒重的“1.2 項(xiàng)下”各對(duì)照品適量，精密稱定，分別置容量瓶中配制成母液；再精密吸取上述各對(duì)照品母液適量，置于50 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷66.89 μg/mL、大黃酸-8-O-葡萄糖苷18.75 μg/mL、大黃酚-1-Oβ-D-葡萄糖苷40.80 μg/mL、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷103.68 μg/mL、蘆薈大黃素-3-（羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷43.65 μg/mL、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷24.96 μg/mL、大黃素甲醚-1-Oβ-D葡萄糖苷33.90 μg/mL、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷20.70 μg/mL、蘆薈大黃素21.87 μg/mL、大黃酸17.73 μg/mL、大黃素22.38 μg/mL、大黃酚19.02 μg/mL 和大黃素甲醚15.93 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm× 4.6 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為磷酸水（pH=3）梯度洗 脫，0 min，A：20%，0～60 min，A：20%～90%，60～70 min，A：90%～100%；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。在上述色譜條件下，測(cè)定各成分的含量。見圖1。

圖1 大黃藥材HPLC含量測(cè)定色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取“2.2 項(xiàng)下”制備的混合對(duì)照品溶液5 μL，按“2.3 項(xiàng)下”方法連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各成分的峰面積，分別計(jì)算RSD值，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)取32 號(hào)大黃樣品共5 份，每份約0.5 g，精密稱定，按 “2.1 項(xiàng)下”方法制備供試品溶液，按 “2.3 項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算上述13 個(gè)成分含量的RSD，結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取32 號(hào)大黃藥材供試品溶液，按“2.3 項(xiàng)下”，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄上述13 個(gè)成分的峰面積，分別計(jì)算其RSD，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知各成分含量的32號(hào)大黃藥材粉末（過四號(hào)篩）約0.25 g，平行6 份，精密稱定，分別加入混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1項(xiàng)下”方法制備供試品溶液，按“2.3 項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算上述13 個(gè)成分的平均回收率及其RSD。見表2。

表2 含量測(cè)定方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

2.4.5 線性范圍考察分別精密吸取按“2.2 項(xiàng)下”方法的混合對(duì)照品0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，即得系列對(duì)照品溶液。按“2.3 項(xiàng)下”色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL 測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的量（ng）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表3。

表3 13個(gè)蒽醌類成分的回歸方程及線性范圍 ng

2.5 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的大黃藥材，按“2.1 項(xiàng)下”方法制備供試品溶液，精密吸取5 μL，按“2.3 項(xiàng)下” 色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，將上述13 個(gè)成分的峰面積代入回歸方程，分別計(jì)算各成分含量。由于同一產(chǎn)地不同批次藥材之間含量存在一定差異，故計(jì)算各個(gè)產(chǎn)地的平均含量。結(jié)果顯示甘肅不同產(chǎn)地之間化學(xué)成分含量差異不大，表明甘肅產(chǎn)大黃藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定；而四川、重慶、湖北、青海等地產(chǎn)大黃藥材中13 個(gè)成分含量與甘肅產(chǎn)有一定差異。見表4。

表4 不同產(chǎn)地大黃藥材中13個(gè)蒽醌類成分含量（n=3） %

2.6 指紋圖譜測(cè)定與相似度評(píng)價(jià)

2.6.1 指紋圖譜測(cè)定分別取62 批大黃藥材樣品及大黃（掌葉大黃）對(duì)照藥材，按“2.1 項(xiàng)下”方法制備供試品溶液，按“2.3 項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。將上述供試品色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”軟件，以對(duì)照藥材指紋圖譜作為參照，經(jīng)多點(diǎn)校正和自動(dòng)匹配生成大黃藥材指紋圖譜共有模式，62 批大黃藥材HPLC 指紋圖譜見圖2，大黃（掌葉大黃）對(duì)照藥材圖譜見圖3。

圖2 62批大黃藥材指紋圖譜

圖3 掌葉大黃對(duì)照藥材圖譜

2.6.2 相似度分析采用2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（V2.0，國(guó)家藥典委員會(huì)）軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。見表5。62 批大黃藥材指紋圖譜與對(duì)照藥材圖譜相似度范圍為0.576～0.965，說明不同產(chǎn)地之間大黃藥材的質(zhì)量存在一定差異。除S9 外，甘肅各地產(chǎn)大黃藥材指紋圖譜與對(duì)照藥材指紋圖譜相似度均大于0.85，表明甘肅產(chǎn)大黃藥材質(zhì)量較穩(wěn)定；四川、湖北、重慶及青海等地產(chǎn)大黃藥材指紋圖譜與對(duì)照藥材指紋圖譜相似度范圍分別為0.749～0.822、0.772～0.783、0.765～0.817、0.576～0.753，表明四川、重慶、湖北等地產(chǎn)大黃藥材質(zhì)量相近，與甘肅產(chǎn)有一定差異；青海產(chǎn)大黃藥材質(zhì)量與甘肅產(chǎn)差異較大。

表5 62批大黃藥材相似度分析結(jié)果

（續(xù)表）

2.7 系統(tǒng)聚類分析

聚類分析又稱集群分析, 它是研究“物以類聚”的一種數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，可將觀察對(duì)象依據(jù)某些數(shù)量特征加以歸類，在現(xiàn)今中藥質(zhì)量控制，品種分類等方面被廣泛使用［16］。本研究以14 號(hào)峰為參照峰，計(jì)算62 批不同產(chǎn)地大黃藥材指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積，將其導(dǎo)入SPSS 21.0 軟件，采用組間連接法，以卡方距離為測(cè)度對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析。如圖4 所示，當(dāng)卡方距離為10 時(shí)，62 批大黃樣品可分為5 類，第1 類包含S42～S55 和S61、S62，即四川、重慶及湖北等地產(chǎn)大黃藥材被聚為一類；S56～S59為第2 類，即青海產(chǎn)大黃藥材；S1～S41 為甘肅產(chǎn)大黃藥材，其中S9 單獨(dú)分為第3 類，其余樣品分為第4 類和第5 類。從分類結(jié)果可看出，甘肅不同產(chǎn)地大黃藥材的分類存在著產(chǎn)地相互交叉的現(xiàn)象，四川、湖北及重慶產(chǎn)大黃藥材可與甘肅及青海產(chǎn)大黃藥材區(qū)分開。聚類分析結(jié)果與相似度分析結(jié)果基本一致。

圖4 62批大黃藥材系統(tǒng)聚類分析樹狀圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同提取方法（超聲提取、加熱回流提?。⑻崛∪軇ㄒ掖?、甲醇、70%甲醇）、提取時(shí)間（30、60、90 min）、溶劑量（25、50 mL）等因素進(jìn)行考察，從提取的全面性、穩(wěn)定性及操作便捷性等方面考慮，確定最佳提取條件為0.5 g 藥材粉末加50 mL 甲醇，水浴回流60 min。

實(shí)驗(yàn)中比較了甲醇-水（冰乙酸調(diào)pH=3）、甲醇-水（磷酸酸調(diào)pH=3）、乙腈-水（冰乙酸調(diào)pH=3）3 種不同的流動(dòng)相，結(jié)果表明以甲醇-水（磷酸調(diào)pH=3）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，分離效果較好，特征峰明顯，整體基線較平穩(wěn)；對(duì)254、283、296、330、360 nm 等不同波長(zhǎng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在254 nm 波長(zhǎng)下，圖譜信息較為全面，各峰響應(yīng)值較高，故選擇254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)；考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃時(shí)柱溫對(duì)分離度的影響，結(jié)果在25 ℃條件下，分離度較好。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC 色譜法同時(shí)測(cè)定了62 批大黃藥材中13 個(gè)蒽醌類化合物的含量，并對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)中共選用了兩個(gè)品種的大黃，其中甘肅產(chǎn)大黃為掌葉大黃，四川、重慶、湖北、青海產(chǎn)大黃均為藥用大黃。從含量測(cè)定結(jié)果可看出，甘肅各產(chǎn)地大黃藥材中化學(xué)成分含量接近，與四川、重慶、湖北、青海產(chǎn)大黃有一定差異，相似度分析及聚類分析結(jié)果也將甘肅產(chǎn)大黃歸為一類，與其它省份大黃區(qū)分開。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘肅產(chǎn)大黃質(zhì)量較穩(wěn)定，且掌葉大黃與藥用大黃之間有明顯的質(zhì)量差異，因此在經(jīng)方制劑生產(chǎn)過程中，兩種大黃藥材不宜等質(zhì)替換。S9 為禮縣大黃，與禮縣其它批次藥材質(zhì)量差別較大（相似度為0.709），且聚類分析單獨(dú)分為一類，推測(cè)可能是由于取樣部位不同導(dǎo)致的個(gè)體差異［4］。

經(jīng)典名方作為中醫(yī)理論的載體，臨床治病的主要方法，事關(guān)中醫(yī)的理法方藥體系、臨床應(yīng)用以及產(chǎn)業(yè)振興，是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的關(guān)鍵［17］，中藥材是中醫(yī)防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響經(jīng)方療效的好壞。當(dāng)前我國(guó)中藥市場(chǎng)較為混亂，以假亂真，以次充好，非法加工等現(xiàn)象較為普遍［18］，為改善這一現(xiàn)狀，政府機(jī)構(gòu)除加大對(duì)中藥材及中藥飲片市場(chǎng)的指導(dǎo)及監(jiān)管力度，提高從業(yè)人員業(yè)務(wù)素質(zhì)及道德水平外，還應(yīng)進(jìn)一步完善中藥材的質(zhì)量控制體系。本實(shí)驗(yàn)建立多成分定量與指紋圖譜相似度分析、聚類分析相結(jié)合的方法，用以初步評(píng)價(jià)不同品種及不同產(chǎn)地大黃藥材間的質(zhì)量差異。建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，不僅可為大黃藥材的分類、品質(zhì)分析及完善其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，也可為經(jīng)典名方小承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)的成功研制提供保障。