房政鈺，王雪，邢逞，龔寧波，呂揚

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

芒柄花素又稱刺芒柄花素、芒柄花黃素、7-羥基-4’-甲氧基異黃酮，屬于異黃酮類化合物，廣泛存在于黃芪、甘草和葛根等豆科植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、降血脂、調(diào)節(jié)激素等多種藥理作用[1-7]，可作為化療藥佐劑用于癌癥治療并緩解化學(xué)治療所致的神經(jīng)毒性[8]，可調(diào)節(jié)血壓、血脂，用于預(yù)防和治療心血管疾病[9]。芒柄花素水溶性差、不易吸收、生物利用度低，當(dāng)前人們常通過化學(xué)衍生化或制備其納米制劑提高藥效[9-11]。

藥物的固體存在狀態(tài)可直接影響藥物的理化性質(zhì)、生物利用度、安全性和有效性，其種類主要有無定型態(tài)、單組分多晶型、水合物、溶劑化物、鹽和共晶[12]。藥物共晶是一種新型藥物固體狀態(tài)，它通過共晶中不同組分間的非共價相互作用形成多組分化合物，在共晶形成過程中不會破壞分子原有的共價鍵，但可通過共晶技術(shù)改善藥物的穩(wěn)定性、溶解性、生物利用度[13-14]。共晶制備方法包括溶劑揮發(fā)法、研磨法、懸浮液法、升華法和融化法等，其制備方法大多簡單易行，實驗周期短，易于在工業(yè)制藥中推廣[15]。前期文獻調(diào)研中筆者未見芒柄花素共晶的報道，本研究通過共晶技術(shù)改善芒柄花素的溶解度，選擇4，4’-聯(lián)吡啶作為配體通過懸浮液法和加液研磨法與芒柄花素形成共晶，利用核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、粉末X射線衍射法(powder X-ray diffraction，PXRD)、紅外光譜法(infrared spectroscopy，IR)、差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)對其進行表征，分析分子間相互作用，為揭示芒柄花素共晶的形成機制提供了技術(shù)支撐。溶解性和穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，在0.5%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液中芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶的溶解度有所提高，且共晶在高溫、高濕和光照下均保持穩(wěn)定，為進一步開發(fā)芒柄花素共晶藥物奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Rigaku D/max-2550粉末X射線衍射儀(日本理學(xué)Rigaku公司)；DSC1型差示掃描量熱儀(瑞士Mettler Toledo公司)；Spectrum 400型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)；XS105 Dual Range型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；RC12AD型溶出實驗儀(TDTF天大天發(fā)有限公司，配RZQ-12D取樣收集系統(tǒng))；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配DAD檢測器)；Bruker AVANCE III-500超導(dǎo)傅里葉變化核磁共振波譜儀(500 M，瑞士Bruker公司)。

1.2試藥 芒柄花素：南京特拉維斯生物科技有限公司，含量>98.0%；4，4’-聯(lián)吡啶：九鼎化學(xué)有限公司，含量>98%；實驗中使用的溶劑均為分析純，實驗用水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1共晶制備 取芒柄花素原料藥268 mg，4，4’-聯(lián)吡啶原料藥156 mg置于潔凈的錐形瓶內(nèi)，加入乙醇5 mL于室溫(25 ℃)轉(zhuǎn)速300 r·min-1條件下攪拌12 h，濾過取濾餅；或取芒柄花素原料藥268 mg，4，4’-聯(lián)吡啶原料藥156 mg置于潔凈的研缽，加入乙醇5 mL于室溫中研磨30 min，60 ℃條件下減壓干燥24 h得粉末即為芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶。

2.2共晶表征

2.2.1NMR分析共晶表征 NMR波譜分析是利用NMR對物質(zhì)進行定性、定量分析和結(jié)構(gòu)測定一種方法，它可以提供共晶結(jié)構(gòu)中氫原子和碳原子的數(shù)目，確定活性藥物成分和配體比例，分析分子結(jié)構(gòu)和分子間作用力，為共晶的形成提供有力依據(jù)[16]。取芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶10 mg溶于二甲亞砜(DMSO)-d6溶劑中，溫度為24.85 ℃(298 K)，進行核磁共振氫譜和碳譜測定。

芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶的1H-NMR譜見圖1。1H-NMR(500 MHz，DMSO) δ 10.83(1H，s，7-OH)，8.35(1H，s，2-H)，7.98(1H，d，J=8.8 Hz，5-H)，7.51(2H，d，J=8.8 Hz，2’，6’-H)，6.99(2H，d，J=8.8 Hz，3’，5’-H)，6.95(1H，dd，J=8.8，2.3 Hz，6-H)，6.88(1H，d，J=2.3 Hz，8-H)，3.79(3H，s，7’-H)歸屬為芒柄花素中H原子的化學(xué)位移信號，8.73(2H，dd，J=4.5，1.6 Hz)和7.84(2H，dd，J=4.5，1.6 Hz)分別歸屬為4，4’-聯(lián)吡啶中的鄰位氫和間位氫的特征峰。對比文獻可知芒柄花素在形成共晶后7-OH的化學(xué)位移向低場移動[17]，可能與形成共晶時7-OH形成分子間氫鍵有關(guān)。共晶的13C-NMR譜如圖1所示，13C-NMR(126 MHz，DMSO) δ 175.12(C=O)，163.08(C-7)，159.45(C-4’)，157.96(C-9)，153.70(C-2)，130.60(C-2’，C-6’)，127.83(C-5)，124.74(C-1’)，123.65(C-3)，117.12(C-10)，115.70(C-6)，114.10(C-3’，C-5’)，102.64(C-8)，55.65(C-7’)歸屬為芒柄花素特征峰，151.09，144.82和121.81歸屬為4，4’-聯(lián)吡啶特征峰。通過1H-NMR和13C-NMR譜分析可知，該共晶中含有芒柄花素和4，4’-聯(lián)吡啶[17-19]。

圖1 芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶1H-NMR和13C-NMR圖譜 Fig.1 1H-NMR and 13C-NMR spectra of formononetin-4，4'-bipyridine cocrystal

2.2.2PXRD共晶表征 PXRD分析是通過多晶粉末對X射線衍射分析晶體結(jié)構(gòu)的一種方法，粉末衍射圖譜被認(rèn)為是晶態(tài)樣品的指紋圖譜，當(dāng)衍射峰的位置、強度和形狀發(fā)生變化時，證明有新晶相的形成，可用于共晶的鑒別[20]。取等量芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶原料藥以及共晶(約50 mg)，研磨成細粉狀，上機測試PXRD圖譜。測試條件為：CuKα，λ=1.54178 ?，管壓40 kV、管流150 mA，2θ掃描范圍為3°～ 40°，步長0.02°，掃描速度為8°·min-1。

PXRD圖譜見圖2。芒柄花素位于7.46°，9.84°，14.90°，16.22°，24.44°，25.18°，30.02°，30.74°和32.78°處衍射峰消失；4，4’-聯(lián)吡啶位于10.34°，12.38°，13.38°，17.78°，18.52°，19.54°，21.72°，22.56°，24.94°，25.28°和25.86°處的衍射峰消失；而芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶在7.32°，8.98°，16.10°，18.90°，20.44°，21.24°和23.68°處有新衍射峰出現(xiàn)，上述共晶的PXRD圖譜中衍射峰的位置、強度和形狀相較于原料藥均發(fā)生變化，證明新的物相形成。

圖2 芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶及共晶PXRD圖譜 Fig.2 PXRD patterns of formononetin，4，4'-bipyridine and their cocrystal

2.2.3IR分析法共晶表征 IR是依據(jù)分子振動能級與轉(zhuǎn)動能級躍遷引起的吸收光譜，在形成藥物共晶時，原料藥中氫鍵等分子間作用力發(fā)生變化，會引起分子振動能級與轉(zhuǎn)動能級的改變，致使紅外特征吸收峰的強度、位置發(fā)生改變，因此可通過IR分析共晶中的分子間作用力，輔助判斷共晶的形成[21]。分別稱取芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶原料藥以及共晶樣品適量，采用衰減全反射法進行IR分析檢測，掃描次數(shù)16次，4000～ 650 cm-1全譜掃描，記錄紅外譜圖。

IR分析結(jié)果見圖3。芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶在3091，3053，2931，1620，1598，1538，808，731 cm-1產(chǎn)生紅外吸收峰，其中3053 cm-1歸屬于不飽和碳的νC-H，2931和1620 cm-1分別歸屬于芒柄花素中甲基碳的νC-H和νC=O，1598和1538 cm-1的吸收峰歸屬于νC=C和νC=N，位于808和731 cm-1的吸收峰歸屬于芳香環(huán)δAr-H。由IR分析可知，共晶由芒柄花素及4，4’-聯(lián)吡啶兩部分組成，且與芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶IR圖譜比較，共晶的IR圖譜在官能團特征區(qū)νO-H(2800～3600 cm-1)發(fā)生變化，芒柄花素中νO-H=3126 cm-1，在形成共晶時νO-H紅移與不飽和碳的νC-H在3053 cm-1附近一起形成吸收峰，可能是芒柄花素中的O-H與4，4’-聯(lián)吡啶中兩端的N原子形成氫鍵所致，因此芒柄花素與4，4’-聯(lián)吡啶之間可能通過C=N…H-O的相互作用形成共晶，紅外吸收光譜分析佐證芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶形成了新的物質(zhì)，可作為共晶鑒別的輔助手段。

圖3 芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶及共晶IR圖譜 Fig.3 IR spectra of formononetin，4，4'-bipyridine and their cocrystal

2.2.4DSC共晶表征 DSC分析是一種熱分析技術(shù)，通過研究樣品在程序控溫下的熱力學(xué)行為，可判斷樣品中是否含有結(jié)晶溶劑，在藥物共晶的鑒別、純度檢驗、熔點測定等方面發(fā)揮著不可替代的作用[22]。分別稱取芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶原料藥以及共晶樣品約2 mg，置于帶蓋鋁坩堝中，以空鋁坩堝作為參比，N2氣氛50 mL·min-1，掃描范圍：30～350 ℃，升溫速率：10 ℃·min-1，記錄吸熱曲線，采用STARe數(shù)據(jù)處理軟件處理圖譜。

DSC圖譜見圖4。芒柄花素的熔點為267.00 ℃，4，4’-聯(lián)吡啶的熔點和沸點為112.25和296.18 ℃，芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶在上述溫度下未產(chǎn)生吸熱峰，表明所形成的共晶純度較高沒有原料藥剩余，且在202.20 ℃處產(chǎn)生不同于原料藥的新吸熱峰，表明有新晶相形成。芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶熔點在202.20 ℃，所形成的共晶熔點低于芒柄花素原料藥，因此可通過形成藥物共晶降低藥物熔點，改變藥物的穩(wěn)定性和溶解性。

圖4 芒柄花素、4，4’-聯(lián)吡啶及共晶DSC圖譜 Fig.4 DSC spectra of formononetin，4，4'-bipyridine and their cocrystal

2.2.5溶解度實驗 分別稱取過孔徑0.15 mm(100目)藥篩的30 mg芒柄花素當(dāng)量的原料藥和共晶，分別加入溶出介質(zhì)450 mL(0.5% SDS緩沖溶液)于溶出實驗儀，采用槳法，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，分別5，15，30，60，90，120，180，240，360和480 min取樣，用孔徑0.22 μm濾膜濾過，續(xù)濾液用高效液相色譜法分析測定樣品的溶解性能。色譜條件[23]：Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈和0.2%磷酸溶液梯度洗脫10 min(0 min，30%乙腈：70%磷酸溶液，10 min，60%乙腈：40%磷酸溶液)，后運行5 min，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長為272 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。平行重復(fù)3次實驗。

利用高效液相色譜法對樣品溶解含量進行檢測，以時間為橫坐標(biāo)，溶出濃度為縱坐標(biāo)繪制溶出曲線，計算溶出曲線的相似因子f2值。芒柄花素原料藥及共晶在0.5% SDS緩沖液中的溶解度結(jié)果見圖5。在0.5% SDS緩沖液中，芒柄花素原料藥的平衡溶解度(13.5±0.4) μg·mL-1，芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶的平衡溶解度為(35.2±1.7) μg·mL-1，共晶相比于芒柄花素原料藥溶解度提高了2.61倍，f2=37，f2<50，可見芒柄花素在形成共晶時溶解度有明顯改善，因此芒柄花素可通過與4，4’-聯(lián)吡啶形成共晶提升其溶解度。

圖5 芒柄花素和芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶的溶出曲線 Fig.5 Dissolution profiles of formononetin and formononetin-4，4'-bipyridine cocrystal

2.2.6穩(wěn)定性實驗 稱取芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶樣品100 mg分別放置于敞口的培養(yǎng)皿中，按穩(wěn)定性重點考察項目進行檢測，并于第0天、第5天和第10天取樣50 mg，利用PXRD方法對不同時間點的晶型狀態(tài)進行分析。實驗條件：高溫實驗條件為(60±1) ℃溫度下放置0，5，10 d；高濕實驗條件為置于恒濕密閉容器中，在25 ℃溫度下相對濕度(90±5)%條件下放置0，5，10 d；光照實驗條件為放在光照箱內(nèi)，于25 ℃下照度為(4500±500)lx的條件下放置0，5，10 d 。結(jié)果芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶在高溫、高濕及光照條件下均保持穩(wěn)定。

3 討論

芒柄花素是一種異黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、降血脂、調(diào)節(jié)激素等多種藥理作用，但較差的溶解性導(dǎo)致其生物利用度低，限制臨床應(yīng)用。為改善其溶解度從而提高生物利用度，本研究采用懸浮液法和加液研磨法制備獲得了一種全新的芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶。表征分析發(fā)現(xiàn)該共晶具有特征的NMR圖譜、PXRD圖譜、IR圖譜和DSC特征吸熱峰，確證了新共晶物質(zhì)的生成。通過平衡溶解度實驗評價其溶解度，發(fā)現(xiàn)在0.5%SDS條件下該共晶可顯著提高原料藥溶解性，通過考察穩(wěn)定性重點項目，發(fā)現(xiàn)該共晶在高溫、高濕和光照下均保持穩(wěn)定。因此，本研究獲得的芒柄花素-4，4’-聯(lián)吡啶共晶穩(wěn)定性良好，其溶解性明顯優(yōu)于原料藥，具有提高芒柄花素生物利用度的潛力，生物活性實驗及晶體生長在進一步的研究中，本實驗為共晶技術(shù)在改善藥物溶解性方面提供了應(yīng)用基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。