成曉霞，李欣怡，李 微，李慧雯，何鳳琴

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院；西安市秦嶺天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；西安文理學(xué)院 基因工程實(shí)驗(yàn)室，西安 710065)

自由基是一類外層軌道含有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或分子，生物體內(nèi)的自由基過(guò)度積累會(huì)打破氧化還原平衡，過(guò)剩的自由基會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子交聯(lián)或斷裂，破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象或影響生物膜功能，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷、變性，最終走向死亡[1-2]．許多疾病的起源與發(fā)展均與體內(nèi)自由基的過(guò)度積累有關(guān)，如皮膚衰老、血管硬化、線粒體異常、腦組織損傷、細(xì)胞癌變等[3-5]．因此，從天然產(chǎn)物中尋找安全、高效的抗氧化活性物質(zhì)一直以來(lái)熱度不減．目前，體外抗氧化活性評(píng)價(jià)常通過(guò)檢測(cè)自由基清除能力、鐵離子還原能力、氧自由基吸收能力等方式，其中DPPH法和ABTS法是通過(guò)抗氧化劑分別與紫色的DPPH乙醇溶液和藍(lán)綠色ABTS溶液反應(yīng)后，溶液顏色變淡，吸光度值下降程度與自由基清除能力正相關(guān)，從而間接體現(xiàn)物質(zhì)總抗氧化能力，是目前使用最廣泛的檢測(cè)自由基清除能力的方法[6]．FRAP法則是利用抗氧化劑能夠?qū)e3+還原成Fe2+，并在593 nm處有強(qiáng)吸收,結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑的相對(duì)濃度來(lái)表示，此法操作快速、簡(jiǎn)單、重復(fù)性好,是一種被研究者提倡的檢測(cè)天然產(chǎn)物抗氧化活性的方法[7-8]．

大金發(fā)蘚(PolytrichumcommuneL.ex Hedw)是蘚綱、金發(fā)蘚目(Ploytrichales)、金發(fā)蘚科(Polytrichaceae)、金發(fā)蘚屬(PolytrichumHedw)植物，因其孢子體色黃且狀如發(fā)絲而得名[9]．《本草綱目》及《中華本草》收錄其全草入藥，其味甘，性涼，主治久熱不退、肺病咳嗽、盜汗、吐血、便血、崩漏、跌打損傷、子宮脫垂、刀傷出血[10-11]．近年來(lái)的研究表明，大金發(fā)蘚中含有萜類、黃酮類、酚類及具有新穎結(jié)構(gòu)骨架的苯并萘并呫噸酮類化合物及其衍生物、苯乙烯醛基并聯(lián)芐化合物和苯乙烯基并二氫黃酮類化合物等[12-16]．大量研究證明黃酮、酚類化合物具有清除自由基的活性，與抗氧化能力密切相關(guān)[17-23]．因此，本研究通過(guò)評(píng)價(jià)大金發(fā)蘚不同極性組分的抗氧化活性，并分析各組分內(nèi)不同物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)性，旨在為大金發(fā)蘚的合理開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)參考，也為靶向清除自由基活性產(chǎn)物的研發(fā)積累實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大金發(fā)蘚地上全草于 2009 年 8 月采自陜西秦嶺南麓平河梁(海拔 2305 m，33°27′ N，108°30′ E)，經(jīng)陜西師范大學(xué)肖婭萍教授鑒定為大金發(fā)蘚PolytrichumcommuneHedw，標(biāo)本存于西安文理學(xué)院標(biāo)本館(NO.20090016)．

1.1.2 主要試劑

齊墩果酸(oleanolic acid，OA，天津西瑪科技有限公司)，蘆丁(Rutin，上海斯信生物科技有限公司)，沒(méi)食子酸(Gallic acid，GA，sigma公司)，香草醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，BHT(二丁基羥基甲苯)、TPTZ(二硫代蘇糖醇)、DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)、福林酚試劑均購(gòu)自Aldrich公司；95%乙醇、冰醋酸、高氯酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、二甲基亞砜溶液、三氯化鐵、鹽酸、醋酸鈉、過(guò)硫酸鉀均購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司．

1.1.3 儀器設(shè)備

旗艦多功能粉碎機(jī)(Q-500B，上海冰都電器有限公司)；電子天平(BT 125D，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；高功率數(shù)控超聲波清洗器(KH-400KDB，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(R系列，上海申生科技有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，常州普森電子儀器廠)；移液器(Pipetman Neo P200N、P1000N，吉爾遜實(shí)驗(yàn)儀器(上海)有限公司)；可見(jiàn)光分光光度計(jì)(722 s，上海棱光技術(shù)有限公司)；吸收光酶標(biāo)儀(EUX800，基因有限公司)．

1.2 方法

1.2.1 大金發(fā)蘚提取物制備

稱取大金發(fā)蘚粉末400 g，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的1.2 L乙醇，在功率為400 W的超聲下提取30 min，真空抽濾，殘?jiān)尤塍w積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇1.2 L，重復(fù)超聲提取，條件同前．收集合并上述兩次提取液，揮干有機(jī)溶劑后得醇提浸膏，將浸膏用蒸餾水混懸，依次分別用極性逐漸增加的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到石油醚萃取液、氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，分別揮干有機(jī)溶劑得到極性由小到大的不同組分樣品，稱重，計(jì)算得率．

1.2.2 大金發(fā)蘚提取物含量測(cè)定

1.2.2.1 萜類含量測(cè)定 ①精確稱取齊墩果酸用乙醇溶解，配制0.803 6 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液；②將5 g香草醛溶于冰醋酸，定容到100 mL，制備5%香草醛-冰醋酸溶液；③取待測(cè)樣品0.2 mL揮干后加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸和0.8 mL高氯酸，搖勻后70℃反應(yīng)15 min，冰水浴10 min，加入5 mL冰醋酸，搖勻靜置10 min，測(cè)定550 nm的溶液吸光度。

1.2.2.2 黃酮含量測(cè)定 ①精確稱取蘆丁用乙醇溶解，配制0.991 8 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液；②分別將5 g亞硝酸鈉、10 g硝酸鋁、4 g氫氧化鈉溶于蒸餾水，定容到100 mL，制備5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液；③取樣品0.6 mL與70%乙醇混合至2 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置5 min，然后加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，最后加入4% 氫氧化鈉溶液3 mL，搖勻靜置15 min，測(cè)定510 nm的溶液吸光度。

1.2.2.3 總酚含量測(cè)定 ①精確稱取沒(méi)食子酸溶于超純水，制備0.256 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液；②將20 g碳酸鈉溶于純水，定容至100 mL，制備20%碳酸鈉溶液；③取樣品0.2 mL與70%乙醇混合至1 mL，加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，混勻后加0.5 mL福林酚試劑，最后加純水2 mL混勻反應(yīng)1h后測(cè)定760 nm的溶液吸光度。

1.2.3 抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.3.1 DPPH法 ①試劑配制：用無(wú)水乙醇配制濃度為0.024 mg/mL的DPPH溶液；②樣品檢測(cè)：將 DPPH溶液與待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品(BHT)等比例混合均勻，避光振搖5 min后靜置15 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值；③BHT作為陽(yáng)性對(duì)照，以不同濃度的BHT溶液為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用待測(cè)樣品的吸光度平均值進(jìn)行換算，所得結(jié)果以BHT當(dāng)量代表其抗氧化能力．

1.2.3.2 ABTS法 ①試劑配制：用PBS溶液分別配制濃度為3.841 mg/mL的ABTS溶液和0.662 mg/mL的過(guò)硫酸鉀溶液，將上述兩種溶液按照等比例混合搖勻，室溫避光反應(yīng)12～16 h，制成ABTS儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液與pH 7.0～7.2 的PBS溶液以1∶19比例混勻作為ABTS工作液；③樣品檢測(cè)：將等體積ABTS工作液與待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品(BHT)混合均勻，室溫條件下于90 min內(nèi)測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處的吸光度值；④BHT作為陽(yáng)性對(duì)照，以不同濃度的BHT溶液為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用待測(cè)樣品的吸光度平均值進(jìn)行換算，所得結(jié)果以BHT當(dāng)量代表其抗氧化能力．

1.2.3.3 FRAP法 ①試劑配制：稱取1.23 g醋酸鈉溶解于50 mL蒸餾水中配成300 mM醋酸鈉溶液，稱取0.015 6 g TPTZ溶解于5 mL 40 mM的鹽酸中配成10 mM TPTZ溶液，稱取0.027 g三氯化鐵溶解于5 mL蒸餾水中配制成20 mM三氯化鐵溶液，取上述3種溶液按照10∶1∶1的比例混合搖勻，于37℃水浴3 min；②樣品檢測(cè)：向3 mL FARP工作液中加入0.1 mL待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品(BHT)混合均勻，于室溫45～135 min內(nèi)在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值；③BHT作為陽(yáng)性對(duì)照，以不同濃度的BHT溶液為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用待測(cè)樣品的吸光度平均值進(jìn)行換算，所得結(jié)果以BHT當(dāng)量代表其抗氧化能力．

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 大金發(fā)蘚極性組分含量分析

分別以不同濃度的齊墩果酸、蘆丁、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制萜類、黃酮和酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程如表1所示．分別測(cè)定不同樣品的吸光度值，參考表1的回歸方程，換算大金發(fā)蘚各極性組分的含量結(jié)果見(jiàn)圖1.

表1 不同活性物質(zhì)組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 大金發(fā)蘚極性組分的含量測(cè)定

由圖可知，石油醚組分中各活性物質(zhì)含量由高到低的順序?yàn)椋喝?黃酮>總酚；氯仿組分中各活性物質(zhì)含量由高到低的順序?yàn)椋喝?黃酮>總酚；乙酸乙酯組分中各活性物質(zhì)含量由高到低的順序?yàn)椋喝?黃酮>總酚；水飽和正丁醇組分中各活性物質(zhì)含量由高到低的順序?yàn)椋喝?黃酮>總酚．整體來(lái)說(shuō)，不同的極性組分中都含有三萜、黃酮、總酚等活性物質(zhì)，且各組分中的三萜含量最高，黃酮含量次之，總酚含量最低．

2.2 大金發(fā)蘚抗氧化活性評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用食品加工領(lǐng)域中常用的抗氧化劑BHT(butylated hydroxytoluene) 作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，其化學(xué)名稱為2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，分子式：C15H24O，穩(wěn)定性較好．通過(guò)DPPH、ABTS、FRAP方法分別測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，以BHT濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程如表2所示，用相同方法測(cè)定大金發(fā)蘚四個(gè)極性組分在不同濃度下的吸光度值，依據(jù)表2換算為不同BHT當(dāng)量，體現(xiàn)其抗氧化能力，結(jié)果見(jiàn)圖2～圖4．

圖4 FRAP法測(cè)定大金發(fā)蘚不同極性組分的抗氧化能力不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

表2 不同抗氧化評(píng)價(jià)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 DPPH法測(cè)定大金發(fā)蘚不同極性組分的抗氧化能力不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

運(yùn)用DPPH法對(duì)大金發(fā)蘚四種極性組分的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2，大金發(fā)蘚中石油醚組分、乙酸乙酯組分、氯仿組分和正丁醇組分的BHT當(dāng)量分別為0.575±0.064、1.561±0.041、0.610±0.172、1.536±0.028 mg/mL．大金發(fā)蘚中乙酸乙酯組分和正丁醇組分抗氧化能力明顯高于石油醚組分和氯仿組分(P<0.05)，依據(jù)DPPH法的結(jié)果，大金發(fā)蘚各組分的抗氧化能力依次為乙酸乙酯組分>正丁醇組分>氯仿組分>石油醚組分．

運(yùn)用ABTS法對(duì)大金發(fā)蘚四種極性組分的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3，大金發(fā)蘚中石油醚組分、乙酸乙酯組分、氯仿組分和正丁醇組分的BHT當(dāng)量分別為0.826±0.062、0.968±0.004、0.743±0.137、0.953±0.035 mg/mL．大金發(fā)蘚中乙酸乙酯組分和正丁醇組分抗氧化能力明顯高于石油醚組分和氯仿組分(P<0.05)，依據(jù)ABTS法的結(jié)果，大金發(fā)蘚各組分的抗氧化能力依次為乙酸乙酯組分>正丁醇組分>石油醚組分>氯仿組分．

圖3 ABTS法測(cè)定大金發(fā)蘚不同極性組分的抗氧化能力不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)

運(yùn)用FRAP法對(duì)大金發(fā)蘚四種極性組分的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4，大金發(fā)蘚中石油醚組分、乙酸乙酯組分、氯仿組分和正丁醇組分的BHT當(dāng)量分別為0.490±0.038、2.155±0.123、0.987±0.110、1.104±0.167 mg/mL．大金發(fā)蘚中乙酸乙酯組分抗氧化能力明顯高于其他三個(gè)組分(P<0.05)，正丁醇組分和氯仿組分的抗氧化能力相當(dāng)，均略高于石油醚組分，依據(jù)FRAP法的結(jié)果，大金發(fā)蘚各組分的抗氧化能力依次為乙酸乙酯組分>正丁醇組分>氯仿組分>石油醚組分．

綜上所述，大金發(fā)蘚四個(gè)極性組分均具有DPPH?清除能力、陽(yáng)離子自由基清除能力(ABTS+)和對(duì)Fe3+的還原力(FRAP)等抗氧化活性，其中乙酸乙酯組分具有最強(qiáng)的抗氧化活性，正丁醇組分次之，氯仿組分和石油醚組分的抗氧化能力均低于前兩個(gè)組分．

2.3 大金發(fā)蘚極性組分中各活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

分別將大金發(fā)蘚四個(gè)極性組分中各成分的含量與抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3～表6所示．

表3 大金發(fā)蘚石油醚組分活性物質(zhì)與抗氧化能力相關(guān)性分析

大金發(fā)蘚石油醚組分各活性成分和抗氧化能力的相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示，用3種不同的方法檢測(cè)，石油醚組分中的三萜含量與其抗氧化活性均有顯著相關(guān)性(P<0.05)；黃酮與DPPH?清除能力極顯著相關(guān)(P<0.01)，與陽(yáng)離子自由基清除能力顯著性相關(guān)(P<0.05)，卻未表現(xiàn)出對(duì)Fe3+的還原力；總酚的含量與還原Fe3+的能力極顯著相關(guān)(P<0.01)，并能顯著影響清除陽(yáng)離子的能力(P<0.05)，卻并不能影響DPPH?清除能力．

大金發(fā)蘚氯仿組分各活性成分和抗氧化能力的相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示，三萜的含量可對(duì)陽(yáng)離子的清除能力產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)，同時(shí)也可顯著影響DPPH?清除能力和對(duì)Fe3+的還原能力(P<0.05)；黃酮的含量可對(duì)Fe3+的還原能力產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)，并與陽(yáng)離子自由基清除能力顯著性相關(guān)(P<0.05)，卻未表現(xiàn)出DPPH?清除能力；總酚的含量與陽(yáng)離子清除能力密切相關(guān)(P<0.01)，同時(shí)對(duì)DPPH?清除能力和Fe3+的還原力產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)．

表4 大金發(fā)蘚氯仿組分活性物質(zhì)與抗氧化能力相關(guān)性分析

大金發(fā)蘚乙酸乙酯組分各活性成分和抗氧化能力的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表5，三萜和總酚的含量均可顯著影響DPPH?、陽(yáng)離子自由基清除能力和對(duì)Fe3+的還原力(P<0.05)；黃酮與DPPH?和陽(yáng)離子自由基清除能力極顯著相關(guān)(P<0.01)，卻未表現(xiàn)出對(duì)Fe3+的還原力．

表5 大金發(fā)蘚乙酸乙酯組分活性物質(zhì)與抗氧化能力相關(guān)性分析

大金發(fā)蘚正丁醇組分各活性成分和抗氧化能力的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表6，三萜的含量可對(duì)Fe3+的還原力產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)，并與DPPH?、陽(yáng)離子自由基清除能力呈顯著性相關(guān)(P<0.05)；黃酮的含量?jī)H可影響DPPH?清除能力(P<0.05)，卻與陽(yáng)離子自由基清除能力和對(duì)Fe3+的還原力無(wú)關(guān)；總酚的含量可顯著影響清除陽(yáng)離子與還原Fe3+的能力(P<0.05)，卻并不能影響DPPH?清除能力．

表6 大金發(fā)蘚正丁醇組分活性物質(zhì)與抗氧化能力相關(guān)性分析

2.4 大金發(fā)蘚不同活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

根據(jù)大金發(fā)蘚不同極性組分的抗氧化能力排序進(jìn)行加權(quán)，乙酸乙酯組分、正丁醇組分、氯仿組分和石油醚組分的權(quán)重分別為4、3、2、1，每個(gè)組中出現(xiàn)極顯著相關(guān)性(P<0.01，用“★★”表示)的可得到對(duì)應(yīng)的權(quán)重系數(shù)，加和的系數(shù)總量與抗氧化能力呈正相關(guān)，綜合表3～表6的數(shù)據(jù)，繪制表7如下．

表7 大金發(fā)蘚活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

由表7綜合分析可知，大金發(fā)蘚中的黃酮類化合物對(duì)清除DPPH?和陽(yáng)離子自由基，以及還原Fe3+表現(xiàn)出極強(qiáng)活力，是大金發(fā)蘚抗氧化的主力軍．同時(shí)，大金發(fā)蘚中的三萜類物質(zhì)也表現(xiàn)出了較好的抗氧化能力，其與陽(yáng)離子自由基的清除和對(duì)Fe3+的還原密切相關(guān)，此前的研究提示萜類物質(zhì)具有抗腫瘤的活性，結(jié)合這兩者可推測(cè)氧化應(yīng)激與癌癥發(fā)生的潛在聯(lián)系．而大金發(fā)蘚中的酚類物質(zhì)雖也能表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，但活性不及其他兩種成分．

3 結(jié)論

通過(guò)DPPH、ABTS和FRAP這三種不同的方法，考察了分別含有三萜、黃酮和酚類的大金發(fā)蘚石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇組分對(duì)DPPH?、陽(yáng)離子自由基的清除能力，以及對(duì)Fe3+的還原能力．結(jié)果表明，大金發(fā)蘚的乙酸乙酯組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的體外抗氧化活性．同時(shí)，研究結(jié)果也證明黃酮類化合物是大金發(fā)蘚中貢獻(xiàn)主要抗氧化能力的活性組分．綜上，建議以大金發(fā)蘚乙酸乙酯組分的黃酮類化合物作為重點(diǎn)研發(fā)抗氧化類產(chǎn)品的目標(biāo)組分，優(yōu)化提取工藝并展開(kāi)相關(guān)作用機(jī)制的探究，為大金發(fā)蘚的合理利用、深度開(kāi)發(fā)積累數(shù)據(jù)，為靶向氧化應(yīng)激調(diào)控的相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)提供參考．