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超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定雞肉中氯羥吡啶藥物的殘留

2022-04-28 07:19邢騫文崔沙沙李文香高振同
北方牧業(yè) 2022年7期
關鍵詞:甲酸乙腈液相

邢騫文,崔沙沙,李文香,高振同

(河北省獸藥飼料工作總站,河北 石家莊 050000)

球蟲病是一種常見的寄生蟲病, 寄生蟲寄生于動物體內小腸部位并成倍增值, 進而導致動物組織損傷、采食量降低、養(yǎng)分吸收率下降,最終引起脫水和血液損失等嚴重損害。 氯羥吡啶是我國大量生產且使用最為廣泛的抗球蟲藥物之一,由于其給藥具有持續(xù)性,過量喂食易造成動物體細胞和生殖細胞的染色體、DNA 的畸變和損害[1]。 同時,聚積在動物體內的藥物可能通過食物鏈進入人體,造成潛在危險與隱患。 我國在GB 31650-2019 《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》 中明確規(guī)定雞肉中氯羥吡啶的最高殘留量為5000 微克/千克,但目前對于氯羥吡啶的檢測方法非常有限, 關于雞肉的相關報道更是屈指可數(shù), 主要為高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法[2-6]。 相較于前兩種方法,液相色譜-串聯(lián)質譜法的前處理時間短、有機試劑消耗量小,是分析氯羥吡啶殘留較為理想的方法。 本文在超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法基礎上,通過簡易優(yōu)化相關實驗步驟,提高了實驗效率、減少了有機試劑的消耗和污染, 為今后更加便捷快速地開展雞肉中氯羥吡啶殘留的檢驗檢測工作提供了有力支撐和保證。

1 儀器和材料

1.1 試劑及材料

1.2 儀器

UPLC-XEVO TQ-S 超高效色譜儀-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀(Waters 公司);BP211D 電子天平(賽多利斯公司);JJ200 電子天平(美國雙杰兄弟);VXMTDG 渦旋振蕩儀 (奧豪斯公司);KQ-500DV 超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司 );HERAEUS BIOFUGE STRATOS CENTRIFUGE 離心機(Thermo 公司);N-EVAP112 氮吹儀(美國Jnc);MS3 digital 渦旋混合儀(IKA 公司);48PPM 半自動固相萃取儀 (美國J2 Scientific)

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為HSS T3 柱 (2.1 毫米× 50 毫米,1.8 微米);流動相為0.1%甲酸水-乙腈,采用初始比例為0.1%甲酸水-乙腈(95∶5,V/V)的梯度洗脫進行目標藥物的分離(見表1),流速為0.45毫升/分鐘;柱溫為35℃;進樣體積為2 微升。

表1 液相梯度洗脫時間、流動相比例和曲線種類

2.2 質譜條件

串聯(lián)質譜儀電噴霧離子源ESI+; 毛細管電壓設定值為3.00 千伏; 脫溶劑氣溫度設定值為600℃;脫溶劑氣流速設定值為1000 升/小時;碰撞氣流速設定值為0.23 毫升/分鐘。 多反應監(jiān)測藥物離子對及錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2 氯羥吡啶的特征離子對、錐孔電壓和碰撞能量

2.3 樣品前處理

2.3.1 提取方法

稱取均質好的雞肉樣品(2±0.02 克)于50 毫升離心管中,加入10 毫升80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸),2500 轉/分鐘振蕩10 分鐘, 超聲10分鐘,10000 轉/分鐘離心10 分鐘, 上清液作為備用液。

2.3.2 凈化方法

準確移取3.00 毫升備用液過PRiME HLB柱,收集全部過柱液于10 毫升離心管內,氮氣吹干,加入初始比例流動相0.60 毫升復溶。 渦旋1分鐘, 超聲使其充分溶解, 再次渦旋混合后過0.22 微米濾膜,供超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

2.4 基質標的配制及標準曲線的繪制

稱取適量氯羥吡啶標準物質,用甲醇稀釋,配制成濃度約為200 微克/毫升的氯羥吡啶標準儲備液,-20℃保存,有效期6 個月。 用相應的空白樣品基質制備標準濃度系列,分別約為4、10、20、100、400、1000 納克/毫升 (分別相當于測試樣品中約含有4 微克/千克、10 微克/千克、20 微克/千克、100 微克/千克、400 微克/千克、1000 微克/千克的目標化合物),按2.1 和2.2 測定,以上機濃度為橫坐標,以定量峰面積為縱坐標,進行線性回歸計算,得出目標藥物的線性方程和相關系數(shù)。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的選擇

本實驗分別選用0.005 毫升/升乙酸銨水溶液 (含0.05%甲酸)-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈作為流動相體系進行分析。 結果表明當選用0.1%甲酸水-乙腈為流動相時,目標藥物色譜峰形更好, 響應更高, 故最終選用0.1%甲酸水-乙腈作為本實驗流動相。 同時,實驗測試了多種梯度洗脫方式,發(fā)現(xiàn)采用表1 的梯度洗脫對于消除雜峰干擾、分離目標藥物的效果更佳,當流速設置為0.45 毫升/分鐘時,分離效果最佳。

3.2 質譜條件的優(yōu)化

實驗發(fā)現(xiàn)在正離子模式下, 氯羥吡啶可產生較強的[M+H]離子峰,選擇豐度最大的母離子192.0 質荷比及其對應的兩個響應較強的子離子192.0>87.0 質荷比和192.0>101.0 質荷比作為氯羥吡啶的定性離子對,再從該離子對中選擇響應值最高、基質干擾最小的子離子192.0>101.0 質荷比作為定量離子。 通過調諧,最終確定當錐孔電壓為48 伏、碰撞能量分別為29 伏和24 伏時, 對應子離子的響應值最高。

3.3 樣品前處理

3.3.1 提取液的選擇

乙腈與甲醇相比, 可以更好地沉淀樣品中蛋白質,為后續(xù)固相萃取時提供更加干凈的提取液,提高整體凈化效果[7]。 故本實驗選用乙腈和80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)作為提取液進行試驗, 結果發(fā)現(xiàn) 80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸) 作為提取液時,氯羥吡啶特征離子色譜峰的面積更大且計算得出的回收率更高。 因為選用純有機相作為提取液時,會讓除目標藥物之外的雜質通過固相萃取柱, 導致雜質干擾, 影響最終檢測結果。

3.3.2 固相萃取柱的選擇

現(xiàn)有文獻中大多選用堿性氧化鋁柱和silica 柱作為固相萃取柱, 本實驗比較了堿性氧化鋁柱、PRiME HLB柱對于藥物的凈化效果, 發(fā)現(xiàn)PRiME HLB 固相萃取柱不僅無需預洗、淋洗、洗脫等步驟, 并且對氯羥吡啶的萃取效果更好,目標藥物的回收率更高。 同時,比較了該方法與SN/T 3144-2011 的前處理過程與實驗結果,發(fā)現(xiàn)兩者得出的標準曲線和相關系數(shù)近乎一致,但在處理效率、試劑耗材、節(jié)能環(huán)保等方面,本方法都有不可低估的優(yōu)勢。

3.4 標準曲線及檢出限、定量限

配制4、10、20、100、400、1000 納克/毫升的系列氯羥吡啶基質標準工作液,上機測定,以基質標準溶液濃度為橫坐標,定量色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線 (圖1), 回歸方程為:y=2668.96x+5489.83,相關系數(shù)R2 為0.9923,滿足殘留定量分析要求,說明氯羥吡啶利用本方法在4~1000 納克/毫升范圍內呈現(xiàn)良好線性關系。 如圖2 所示,特征離子在10 納克/毫升時的信噪比滿足S/N>10 要求且遠遠高于10,說明本方法相較于SN/T 3144-2011 具有更高的靈敏度, 可以通過本方法確定更精確的檢測線、定量限。

圖1 不同濃度氯羥吡啶的線性關系

圖2 特征離子在10ng/mL 時的信噪比

3.5 方法回收率和相對標準偏差

在前處理前向空白雞肉中添加10、20、100、400 微克/千克的氯羥吡啶藥物進行回收率實驗,每個添加量進行6 次平行性實驗,回收率及相對偏差見圖3、表3。該方法的四個添加水平回收率位于68.0%~90.4%, 相對標準偏差均小于1.5%, 說明該方法的準確度和精密度均得到了很好的保證。

圖3 雞肉添加氯羥吡啶定量離子色譜圖

表3 雞肉中氯羥吡啶的添加回收率的實驗結果

4 結論

本文研究了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測雞肉中氯羥吡啶的方法,通過優(yōu)化提取、 凈化等步驟建立了可信度高、線性良好的快速檢測方法,相較于已報道的方法, 具有明顯的高效率、低耗材、更環(huán)保等優(yōu)勢,能夠滿足國內外對氯羥吡啶的檢測方法與殘留限量的要求,為今后大批量開展雞肉中氯羥吡啶的驗驗檢測工作提供了有力保障。

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