張寧 藺劉亞 李思繁 朱萌

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。寧夏地處我國西北部，是胃癌高發(fā)區(qū)，該地區(qū)胃癌診療現(xiàn)狀具有就診率低、分期晚、轉(zhuǎn)移率高和預(yù)后差等特點(diǎn)[1-2]，深入研究胃癌發(fā)病機(jī)制和基因表達(dá)異常對提升該地區(qū)胃癌的臨床治療效果具有重要意義。近年來，微小RNA(miRNA)分子的研究顯示其可能參與包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)病過程，可以作為腫瘤早期發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物或藥物治療的分子靶點(diǎn)[3-4]。本文通過實(shí)驗(yàn)研究檢測miR-106a分子在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，在細(xì)胞水平考察異常表達(dá)的miR-106a是否與腫瘤細(xì)胞的異型增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，并進(jìn)一步探討miR-106a參與胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，旨在從體外細(xì)胞水平闡明miR-106a在人胃癌中的表達(dá)和意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

本研究所用胃癌及癌旁配對福爾馬林固定-石蠟包埋(Formalin-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)樣本收集自寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科2020年6月—2021年6月存檔標(biāo)本，共50例，男性34例，女性16例，平均年齡59.45±9.58歲。所有癌組織均經(jīng)病理學(xué)確診為胃腺癌，癌旁組織距癌灶中心≥5 cm，組織學(xué)未見癌細(xì)胞浸潤。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號：2021-N0049)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人低分化胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823、MKN-45，永生化人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。以上細(xì)胞在含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)中于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞在對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 核酸抽提

組織標(biāo)本采用Total Nucleic Acid Isolation Kit(Ambion公司)提取RNA。主要步驟為：10 μm切片脫蠟，蛋白酶K消化4 h，核酸沉淀后離心吸附，DnaseI 37℃ 30 min滅活DNA酶，洗滌離心后純化核酸，分裝15 μL檢測核酸純度，剩余樣本于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?xì)胞標(biāo)本采用Roche High Pure miRNA Isolation Kit(Roche公司)提取RNA。主要步驟為：150 μL細(xì)胞裂解液中加入Binding Buffer和Binding Enhancer，混勻離心，經(jīng)多次洗滌后，加入洗提液孵育1 min，離心純化得到總RNA，分裝備用。

1.4 Real-time PCR檢測miR-106a表達(dá)

采用Small RNA Assays，Universal Master Mix II進(jìn)行PCR檢測。主要步驟為：組織標(biāo)本取10 ng RNA，細(xì)胞標(biāo)本取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄。使用莖環(huán)狀RT引物合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：100 mM dNTP 0.33 μL，MultiScribeTM逆轉(zhuǎn)錄酶2.2 μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液3.3 μL，RNase抑制劑0.42 μL，無酶水9.15 μL，RNA樣本11 μL；反轉(zhuǎn)錄條件：16℃ 30 min、42℃ 30 min、85℃ 5 min、4℃終止。擴(kuò)增體系：Small RNA Assay 3.6 μL，RT產(chǎn)物4.8 μL，Universal PCR Master Mix II 36.0 μL，無酶水27.61 μL，共72.01 μL；擴(kuò)增條件：95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。U6 snRNA為內(nèi)參基因。每組樣本重復(fù)三次。miR-106a相對表達(dá)量采用2-△△Ct表示，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.5 MTT檢測胃癌細(xì)胞增殖

胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823置于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度6 000個(gè)/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后分組處理：陰性對照組、miR-106a inhibitor處理組，于處理后24h、48 h、72 h、96 h加入10% 5 mg/mL MTT液200 μL，避光孵育4 h，棄上清，加入DMSO，搖床震蕩，置于酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司)于490 nm 處測定吸光度值。

1.6 Transwell檢測胃癌細(xì)胞遷移、侵襲

胃癌細(xì)胞BGC-823置于6孔板，細(xì)胞密度2×105個(gè)/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后分組處理：陰性對照組、miR-106a inhibitor處理組，于處理后24 h收集細(xì)胞接種于插入24孔培養(yǎng)板中的Transwell小室，遷移實(shí)驗(yàn)直接接種細(xì)胞，侵襲實(shí)驗(yàn)在小室中鋪Matrigel基質(zhì)膠(BD bioscience公司)，Transwell小室下室加入完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)互不重疊的5個(gè)高倍視野下穿膜細(xì)胞平均數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

生物信息學(xué)分析miR-106a靶基因TIMP2，構(gòu)建包含miR-106a結(jié)合位點(diǎn)的TIMP2 3′-UTR野生型和突變型報(bào)告基因，由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。HEK-293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于96孔板，100 ng pmiR-RB-ReportTMTIMP2野生型(WT)或突變型(Mut)報(bào)告基因與50 nM miR-106a mimic或陰性對照共轉(zhuǎn)染，48 h后使用Dual-Glo Luciferase Assay System檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因，以海腎熒光素酶為內(nèi)參基因。

1.8 Western blot檢測靶蛋白TIMP2、MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin表達(dá)

BGC-823細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度5×105/mL，實(shí)驗(yàn)分組：陰性對照組、miR-106a inhibitor處理組，培養(yǎng)48 h后抽提總蛋白，BCA蛋白定量后取20 μg置入SDS-PAGE凝膠電泳，100 V恒壓，待樣品進(jìn)入分離膠之后，升高電壓至120 V，隨后300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，抗體稀釋比例TIMP2(1∶2 000)，MMP2(1∶2 000)，MMP9(1∶2 000)，E-cadherin(1∶2 000)，N-cadherin(1∶1 000)，GAPDH(1∶10 000)，將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶20 000)孵育后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影和定影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-106a在人胃癌組織中的表達(dá)

Real-time PCR法檢測50例人胃癌和癌旁配對組織樣本，結(jié)果顯示miR-106a在胃癌組織中的相對表達(dá)量高于癌旁組織(2.82±1.90vs.1.03±1.17，t=-7.821，P<0.001)(圖1)。

圖1 Real-time PCR法檢測miR-106a在人胃癌組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of miR-106a was detected in gastric cancer tissues by Real-time PCR

圖2 Real-time PCR法檢測miR-106a在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 The expression of miR-106a was detected in gastric cancer cells by Real-time PCRNote：***P<0.001，when compared with the GES-1 cells.

2.2 miR-106a在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

Real-time PCR法檢測結(jié)果顯示miR-106a相對表達(dá)量在GES-1細(xì)胞和3株人胃癌細(xì)胞SGC-7901(2.51±0.64)、BGC-823(2.44±0.78)和MKN-45(2.32±0.13)中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=223.844，P<0.001)，兩兩比較顯示，相對于GES-1，miR-106a在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)升高(P<0.001)(圖2)。

2.3 miR-106a對人胃癌細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示抑制miR-106a后各時(shí)間點(diǎn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和BGC-823增殖均減慢(P<0.001)，說明抑制miR-106a的表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞增殖(圖3)。

2.4 miR-106a對人胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

Transwell檢測人胃癌細(xì)胞BGC-823，結(jié)果顯示抑制miR-106a后，與NC組相比，anti-miR-106a組遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降(94.23±18.36vs.18.70±17.23，t=99.445，P<0.001)，侵襲細(xì)胞數(shù)也顯著下降(83.00±43.55vs.16.15±8.53，t=18.122，P<0.001)。說明抑制miR-106a的表達(dá)后胃癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量減少，miR-106a的異常表達(dá)對胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力有影響(圖4)。

2.5 miR-106a靶基因TIMP2的鑒定與分析

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，TIMP2野生型和突變型報(bào)告基因與miR-106a mimic共轉(zhuǎn)染后，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.995，P<0.001)。兩兩比較顯示，當(dāng)TIMP2野生型報(bào)告基因與miR-106a mimic共轉(zhuǎn)后，WT/miR-106a熒光素酶報(bào)告基因較活性WT/NC明顯下降(P<0.001)，但TIMP2突變型報(bào)告基因Mut/miR-106a與Mut/NC相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示miR-106a直接調(diào)控靶基因TIMP2表達(dá)(圖5)。

2.6 miR-106a對靶蛋白TIMP2、MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的影響

觀察到miR-106a靶基因TIMP2，結(jié)合miR-106a對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，有必要進(jìn)一步觀察腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子。Western blot檢測結(jié)果顯示，當(dāng)抑制miR-106a后，TIMP2表達(dá)升高，MMP2、MMP9表達(dá)下降；與此同時(shí)，E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin表達(dá)下降，提示miR-106a的異常表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)(圖6)。

圖3 MTT法檢測胃癌細(xì)胞增殖Figure 3 MTT method for the detection of gastric cancer cell proliferationNote：***P<0.001，**P<0.01，compared with control group at the same time.

圖4 Transwell法檢測胃癌細(xì)胞遷移和侵襲Figure 4 The migration and invasion of miR-106a inhibitor were detected in BGC-823 cells by Transwell assayNote：A.Transwell assay results(×200)；B.Trans-membrane cells were counted，***P<0.001.

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-106a與TIMP2 3′-UTR的直接結(jié)合Figure 5 The direct binding of miR-106a and TIMP2 3′-UTR was detected by dual luciferase reporter gene assayNote：***P<0.001，when compared with the WT/NC group.

圖6 Western blotting檢測miR-106a靶蛋白表達(dá)Figure 6 miR-106a target proteins were detected by Western blot

3 結(jié)論

miRNA編碼基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組DNA上，定位于基因間隔區(qū)，生物發(fā)生過程不同于其他基因，轉(zhuǎn)錄后并不翻譯生成蛋白質(zhì)。其生物學(xué)功能在于miRNA以完全或不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合到靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)，發(fā)揮RNAi的作用降解信使(mRNA)或抑制mRNA的翻譯，導(dǎo)致靶基因表達(dá)下降，在轉(zhuǎn)錄后水平對細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行負(fù)性調(diào)控[5-6]。本研究考察miR-106a分子，組織學(xué)采用FFPE樣本，該樣本具有確定的病理組織學(xué)診斷，能夠?yàn)榉肿訖z測用于回顧性研究在基因表達(dá)領(lǐng)域提供很好的平臺。檢測結(jié)果顯示miR-106a在胃癌組織中高表達(dá)，說明至少對胃癌組織而言，miR-106a的表達(dá)出現(xiàn)異常，而高表達(dá)的miR-106a很有可能參與到胃癌的發(fā)病機(jī)制中。細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)miR-106a在胃癌細(xì)胞中同樣出現(xiàn)高表達(dá)。因本研究所選擇的胃癌細(xì)胞株均為低分化，說明至少人低分化胃癌細(xì)胞具有高水平表達(dá)的miR-106a分子。因此，miR-106a在胃癌中的異常表達(dá)就有可能會(huì)影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

細(xì)胞異型增殖是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志。腫瘤細(xì)胞的快速增殖和異常的血管構(gòu)成是導(dǎo)致腫瘤明顯異質(zhì)性的重要原因，也是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要成分。即便是在缺氧微環(huán)境中，休眠的腫瘤細(xì)胞也可以在條件改善時(shí)恢復(fù)或保持旺盛的增殖能力[7]。研究顯示，miR-106a可能通過增強(qiáng)PI3K/AKT通路活性而在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮促進(jìn)作用[8]。PI3K/AKT通路活性的上調(diào)已在多種癌癥中得到證實(shí)與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡障礙和細(xì)胞增殖增強(qiáng)有關(guān)[9]。本研究考察細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)抑制miR-106a后，胃癌細(xì)胞的增殖能力在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)均有所下降，結(jié)合上述報(bào)道，本研究同樣說明胃癌中異常表達(dá)的miR-106a與癌細(xì)胞增殖具有相關(guān)性。

隨后考察胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，發(fā)現(xiàn)抑制miR-106a促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲。為進(jìn)一步分析其可能的作用機(jī)制，我們篩選并分析與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP2，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)二者的直接結(jié)合關(guān)系。因此可以考慮miR-106a對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響可能是通過直接靶位點(diǎn)TIMP2而起作用。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一種階段性過程，其中基底膜的降解是癌細(xì)胞能夠脫離原發(fā)癌灶形成游離癌細(xì)胞的起始階段。在此階段中，EMT轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移動(dòng)力的必需[10-12]。而MMP/TIMP是維持ECM完整性并調(diào)節(jié)ECM重塑的關(guān)鍵[13-14]。為明確miR-106a異常表達(dá)對ECM的作用，經(jīng)蛋白檢測發(fā)現(xiàn)除TIMP2在miR-106a抑制后表達(dá)增高外，MMP2、MMP9的表達(dá)均下降；同時(shí)伴隨著上皮性標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)升高，間質(zhì)性標(biāo)記物N-cadherin表達(dá)降低，說明miR-106a的異常表達(dá)可以導(dǎo)致胃癌細(xì)胞獲得間質(zhì)樣表型，有EMT轉(zhuǎn)化的趨勢；MMP2/9與TIMP2比例失調(diào)，基底膜有可能在miR-106a的作用下得以降解；這兩方面的作用共同促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)合miRNA的作用機(jī)制，miRNA不直接翻譯生成蛋白，但卻可以通過調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá)而發(fā)揮抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果初步揭示miR-106a可能具有癌基因樣的作用，通過靶向TIMP2而促進(jìn)并維持胃癌細(xì)胞的惡性行為。