侯建勛 綜述 王洪斌 審校

世界衛(wèi)生組織預(yù)估了全球180多個(gè)國家將近40種癌癥類型的最新流行情況，以及癌癥的預(yù)后與發(fā)展趨勢(shì)。根據(jù)這項(xiàng)最新的預(yù)估數(shù)據(jù)，全球乳腺癌新發(fā)病例超過了肺癌，成為了全球第一大癌癥。乳腺癌在女性惡性腫瘤中的發(fā)病率為第1位，死亡率為女性的第5位，對(duì)女性產(chǎn)生了巨大的傷害。乳腺癌的病因是多因素的，隨著生活方式的改變，其發(fā)病率也會(huì)隨之發(fā)生變化。如今，人們對(duì)乳腺癌的研究已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，從乳腺癌的發(fā)生發(fā)展到轉(zhuǎn)移侵襲，從藥物治療到臨床手術(shù)治療，再到分子靶向治療。但要促進(jìn)乳腺癌在診療方面的發(fā)展，仍需要進(jìn)一步探索新的治療靶點(diǎn)及其對(duì)乳腺癌診斷以及預(yù)后的影響。

1 外泌體

1.1 外泌體介紹

外泌體是指包含很多復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的小膜泡結(jié)構(gòu)，它廣泛存在并分布于各種體液中，它是一種主要的胞外囊泡(EVs)，攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)和功能性物質(zhì)，參與細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞，包括腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫、心腦血管、干細(xì)胞治療，以及腫瘤以外的免疫調(diào)節(jié)、靶向給藥、組織損傷修復(fù)等，形成了一種全新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，是一種理想的生物標(biāo)記物。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的不同階段，在包括機(jī)體耐藥、免疫微環(huán)境、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、藥物載體運(yùn)輸、調(diào)控細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)等方面，外泌體作為一種潛在的腫瘤生物標(biāo)記物在乳腺癌的診斷和治療中均起著不同程度的作用。外泌體可攜帶多種細(xì)胞組成成分，如細(xì)胞膜蛋白、DNA和RNA，可以參與細(xì)胞間通訊，具有多種生物學(xué)功能及廣泛的臨床應(yīng)用[1]。外泌體除了在細(xì)胞間有良好的通訊功能，還具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，可在生物體內(nèi)運(yùn)輸多種物質(zhì)，如細(xì)胞成分方面的小干擾RNA(siRNA)，乳腺癌治療方面的化療藥物及其載體，免疫調(diào)節(jié)劑和分子靶向藥物。外泌體的生物相容性和不良反應(yīng)少的特質(zhì)使得疾病的發(fā)生發(fā)展與治療的反應(yīng)性和預(yù)后也都可通過外泌體的多重組分分析方法來確定。

1.2 外泌體的提取和檢測(cè)

目前有一些研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)建立許多關(guān)于外泌體研究的數(shù)據(jù)庫，如Vesiclepedia、ExoCarta、EVpedia、EVmiRNA、exoR-Base及ExoBCD等，為外泌體的研究提供了重要資源。外泌體的分離提取方法多種多樣，主要有超速離心法、超濾法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法、排阻色譜法、流控芯片技術(shù)等，但這些方法有其各自的局限性[2-3]。提取外泌體使用最多的方法是超速離心法，更多的研究人員通常聯(lián)合使用兩種方法來分離純化外泌體[4]。

外泌體活體示蹤簡(jiǎn)單的說就是用一些特殊的示蹤劑，如放射核素、熒光蛋白、親脂性染料、造影劑、同位素等標(biāo)記外泌體，用放射同位素不斷發(fā)出特定射線的核物理性質(zhì)和親脂性染料顯示的標(biāo)記實(shí)現(xiàn)追蹤，從而觀察外泌體在生物體內(nèi)的位置和行為，高轉(zhuǎn)移性乳腺癌來源的外泌體在體外會(huì)表現(xiàn)出自我歸巢和體內(nèi)選擇性分布。

目前的活體成像方法有很多，常用的主要有核素分子成像、光學(xué)成像和磁共振成像等。但是親脂染料和熒光蛋白標(biāo)記外泌體都有各自的缺點(diǎn)，給外泌體檢測(cè)的敏感性帶來了挑戰(zhàn)[5]。有研究人員開發(fā)了一類高效、多指標(biāo)檢測(cè)的膜融合囊泡，通過這種融合蛋白和多肽的更精確篩選，在一定程度上可以提高囊泡的融合效率，通過多種核酸分子信標(biāo)的同時(shí)包載，實(shí)現(xiàn)多種腫瘤特異外泌體小RNA(miRNA)的同步檢測(cè)，獲得更豐富的腫瘤診斷信息[6]。

2 外泌體在乳腺癌診斷中的作用

乳腺腫瘤中的外泌體可用來診斷乳腺癌，腫瘤的治療效果可以由腫瘤的外泌體變化反映出來，相關(guān)研究成果表明，外泌體能作為液體活檢的目標(biāo)待測(cè)物用于乳腺癌的診斷。如果將機(jī)體細(xì)胞成分如細(xì)胞膜表面蛋白和RNA等聯(lián)合應(yīng)用于癌癥診斷和預(yù)后評(píng)估，會(huì)在一定程度上增強(qiáng)乳腺癌診斷的特異性和敏感性。外泌體miRNA作為乳腺癌重要的診斷指標(biāo)已被廣泛認(rèn)可，但是目前檢測(cè)外泌體miRNA的方法仍存在耗時(shí)、回收效率低的問題。提取miRNA時(shí)需破壞外泌體，造成miRNA損失并影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以基于外泌體表面蛋白的液體活檢在乳腺癌和其他疾病的診斷上具有潛在應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)其診斷靈敏性和可行性還有待進(jìn)一步提高。

3 外泌體對(duì)乳腺癌治療的影響

3.1 外泌體與機(jī)體耐藥

研究表明，耐藥性是可以通過外泌體在細(xì)胞之間傳遞的，外泌體攜帶細(xì)胞中高表達(dá)的P-gp，以mRNA的形式傳遞信息，進(jìn)而使敏感細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，不過其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[7]。

外泌體相關(guān)的乳腺癌耐藥總結(jié)有以下幾個(gè)方面：腫瘤細(xì)胞通過外泌體直接排出藥物；外泌體核酸載體介導(dǎo)耐藥。外泌體中介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞耐藥的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，可以被包裝到外泌體中，并作為細(xì)胞間通訊信使[8]；外泌體介導(dǎo)的miRNA與乳腺癌耐藥有很大的關(guān)系[9]。有研究表明，耐他莫昔芬乳腺癌細(xì)胞在某種程度上會(huì)通過外泌體這一特殊結(jié)構(gòu)來傳遞miR-9-5p耐藥性，一旦解決了乳腺癌患者對(duì)藥物治療的不良耐受這將會(huì)是乳腺癌治療上的重大突破。同時(shí)這項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞對(duì)TAM(腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)的抵抗力會(huì)因?yàn)閙icroRNA-9-5p(miR-9-5p)外泌體的轉(zhuǎn)移而增強(qiáng)；與此同時(shí)，乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性也因miR-9-5p而發(fā)生了改變[10]；外泌體蛋白載體介導(dǎo)耐藥性以及外泌體介導(dǎo)的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌的耐藥過程中發(fā)揮著重要的作用。外泌體在乳腺癌中介導(dǎo)的幾種耐藥模式和機(jī)制見表1。

3.2 免疫與外泌體的相關(guān)性

腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境(TME)密不可分，而腫瘤和TME之間不斷的相互影響促進(jìn)癌癥的生長(zhǎng)，其中很大一部分是由外泌體介導(dǎo)的。Jena等[18]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體影響成纖維細(xì)胞(CAFs)分化，而CAFs通過外泌體的分泌來調(diào)控腫瘤發(fā)生；腫瘤來源的外泌體直接影響免疫細(xì)胞向TME的募集和遷移，而免疫細(xì)胞來源的外泌體也是乳腺癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的重要貢獻(xiàn)者。外泌體的數(shù)量和質(zhì)量也取決于微環(huán)境的pH值[19]。因此，深入了解腫瘤與微環(huán)境之間的這種雙向相互作用機(jī)制，是開發(fā)新治療策略的必要條件。了解乳腺癌細(xì)胞外泌體的相關(guān)發(fā)展不僅對(duì)了解乳腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展有重要意義，而且在限制目前臨床和臨床前免疫治療的有效性方面也有重要意義[20]。此外，在對(duì)乳腺癌的治療方面，Koh等[21]開發(fā)了一種以增強(qiáng)吞噬作用為目的外泌體，即使是低劑量也能發(fā)揮抗腫瘤的作用。

表1 外泌體在乳腺癌中介導(dǎo)的幾種耐藥模式和機(jī)制

3.3 外泌體與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移

外泌體通過影響腫瘤細(xì)胞代謝增殖的微環(huán)境來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[22-23]；外泌體促進(jìn)腫瘤血管生成也是乳腺癌腫瘤發(fā)生侵襲的條件之一；外泌體有關(guān)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程與影響TME有異曲同工之妙，都會(huì)促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過靶細(xì)胞的表型變化會(huì)誘導(dǎo)非惡性乳腺腫瘤細(xì)胞惡性度發(fā)生改變，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增加能刺激巨噬細(xì)胞極化，這一改變也是乳腺癌轉(zhuǎn)移的有利條件之一；乳腺癌轉(zhuǎn)移患者外泌體MMP9表達(dá)升高，為乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)警和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)[24]；外泌體PD-1高表達(dá)能夠協(xié)助腫瘤免疫逃逸和增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的耐藥性；脂肪MSC-Exo通過激活Hippo信號(hào)通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[25]，這些都是外泌體介導(dǎo)乳腺癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的有力證據(jù)。

3.4 外泌體與藥物載體運(yùn)輸

外泌體具有存在于體內(nèi)的廣泛性和方便獲取的便捷性，其作為藥物等運(yùn)載體具有能被受體細(xì)胞吸收、免疫原性低、運(yùn)輸效率高、穩(wěn)定性好和靶向性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[26-27]。

外泌體能夠通過血腦屏障的這一特殊性質(zhì)，使其在藥物輸送中發(fā)揮了重要作用，并在乳腺癌的藥物治療方面功不可沒，甚至?xí)?duì)以后乳腺癌藥物治療中出現(xiàn)的研究瓶頸有所幫助。外泌體載藥會(huì)作為常用策略來減輕化療和分子靶向治療副作用，提高療效和減輕耐藥性以及化療和分子靶向治療的副作用。由于它起源于患者的生物系統(tǒng)，因此可以克服納米載體的免疫原性、生物相容性、毒性、生物降解性等常見風(fēng)險(xiǎn)[28]。外泌體正逐步發(fā)展成為乳腺癌化療藥物遞送的載體。目前，外泌體藥物裝載的主要方式有轉(zhuǎn)染試劑法、超聲法、凍融循環(huán)法和電穿孔法[29]。

3.5 外泌體調(diào)控分泌和表達(dá)

隨著新的研究進(jìn)展，新型藥物能通過其他機(jī)制影響還原耐藥性，還對(duì)外泌體的形成和釋放有影響[30]，這些藥物會(huì)以不同的方式影響外泌體的分泌和表達(dá)：磺胺異噁唑、鹵夫酮、紫草素等多種藥物可通過抑制外泌體的表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用。

物理相互作用和化學(xué)相互作用對(duì)乳腺腫瘤血管生成、ECM重構(gòu)、細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，外泌體調(diào)控的化學(xué)相互作用其中一項(xiàng)就是細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)[31]。不論是對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響還是對(duì)藥物作用的干擾，外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的方式主要有以下幾種：外泌體膜與靶細(xì)胞膜直接的相互作用；在細(xì)胞外基質(zhì)中，外泌體膜蛋白被細(xì)胞中蛋白酶裂解，釋放出與細(xì)胞膜結(jié)合的成分分子，進(jìn)而激活細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路；外泌體膜可以與靶細(xì)胞膜融合，導(dǎo)致外泌體蛋白、mRNA和miRNA的非選擇性釋放，由此可見，外泌體表面的配體/受體修飾作用也可以應(yīng)用于乳腺癌的治療[32]。

4 小結(jié)與展望

目前來看，乳腺癌治療的主要發(fā)展趨勢(shì)就是分子靶向治療，它具有效果好且副作用少的優(yōu)勢(shì)。通過影響外泌體的合成、抑制外泌體分泌和靶細(xì)胞的攝取，可以改善乳腺癌的化療耐藥，外泌體相關(guān)聯(lián)的乳腺癌耐藥在體內(nèi)和體外都有涉及，但目前的研究成果僅僅局限于體外，體內(nèi)的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探究，這很可能成為乳腺癌化療耐藥研究的新靶點(diǎn)，為乳腺癌的藥物治療提供新方向。除此以外，在最少的額外消耗下獲取更大純度的外泌體用于臨床治療也是一個(gè)挑戰(zhàn)；如何將抗腫瘤藥物或基因等物質(zhì)高效加載到外泌體內(nèi)仍然是亟需解決的技術(shù)問題之一。

目前的外泌體成像示蹤劑在成像應(yīng)用上尚缺乏多層次性，為了更好地追蹤體內(nèi)藥物并因此而有助于治療乳腺癌等其他疾病，多方向、多維度的示蹤劑還需要進(jìn)一步得到開發(fā)，雖是難點(diǎn)但同樣也是研究熱點(diǎn)。此外，外泌體的雙向性質(zhì)，如對(duì)乳腺腫瘤進(jìn)展的貢獻(xiàn)和對(duì)乳腺腫瘤生長(zhǎng)的抑制，使得外泌體作為靶標(biāo)分子治療乳腺癌和開發(fā)新型藥物具有更大的挑戰(zhàn)性。新開發(fā)的藥物對(duì)乳腺癌的治療益處更多還是副作用更多也是需要考慮和探索的方面。大量的單獨(dú)和協(xié)同的測(cè)試都要以外泌體內(nèi)合成的不同物質(zhì)為依據(jù)，以找到更優(yōu)的方式加強(qiáng)乳腺癌的治療效果。相信隨著這些問題的解決，以外泌體為核心引導(dǎo)的乳腺癌診療一體化不久就會(huì)實(shí)現(xiàn)。