李 丹 范學(xué)武 丁 蕾 田 龍 胡逸民

1

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 張家口 075000）

2（河北省人民醫(yī)院 石家莊 050000）

3（張家口市婦幼保健院 張家口 075000）

4（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院 北京 100021）

目前，放療是僅次于手術(shù)的重要腫瘤治療手段，超過50%的癌癥患者需接受放療［1］。放療會導(dǎo)致腫瘤周圍正常組織損傷，表現(xiàn)在皮膚上即為放射性皮炎（Radiodermatitis，RD），并可分為照射后3 個月內(nèi)發(fā)生的急性RD 和3 個月乃至數(shù)年后發(fā)生的慢性RD［1‐2］。85%～90%放療患者存在一定程度的急性RD［3］。由于胸部腫瘤組織淺且距離皮膚近，因此乳腺癌患者放療時普遍并發(fā)較嚴(yán)重的急性RD［4］，該并發(fā)癥增加了治療和護理難度，并降低了患者的生活質(zhì)量，因此需采取有效措施進行防治。常規(guī)防治措施包括外敷藥膏和一般護理，效果均不理想。利用發(fā)光二極管（Light‐emitting diode，LED）發(fā)射的高純度紅光治療［5］是一種防治急性RD的新方法，但相關(guān)臨床效果和作用原理詳述較少。為了量化LED防治急性RD的效果，并解釋其作用原理，本實驗將乳腺癌改良根治術(shù)后放療患者分為對照組和LED 實驗組，通過統(tǒng)計分析兩組RD評分來評估防治效果。通過以皮膚附屬物和微血管為主的組織學(xué)和以白介素‐10（Interleukin‐10，IL-10） 和 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶‐9（Matrix metalloproteinase‐9，MMP-9）為主的基因表達分析來解釋防治原理，以期證明LED 用于急性RD防治的臨床意義與價值，并籍此推廣。

1 資料與方法

1.1 研究對象

篩選2020 年5 月～7 月間于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院放療科住院治療的乳腺癌患者20 名，年齡38～46歲，平均（42.5±3.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）接受改良根治術(shù)后放療；（2）身體質(zhì)量指數(shù)為16～20 kg/m2；（3）放療前皮膚組織密度在1.10～1.15 g/cm3內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已患有皮膚疾??；（2）手術(shù)刀口未愈合或愈合不理想。本實驗通過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 放射治療

所有患者接受標(biāo)準(zhǔn)改良根治術(shù)后預(yù)防性放療。采用Monaco治療計劃系統(tǒng)制定放療計劃：所有患者治療野包括胸壁野和鎖骨上野。胸壁野設(shè)置計劃靶區(qū)采用6 MeV 電子線垂直固定源皮距（100 cm）照射，處方劑量220 cGy/25次，5次/周。鎖骨上野設(shè)置計劃靶區(qū)6 MV X射線等中心成角照射，處方劑量200 cGy/25次，并同步于胸壁野。危及器官劑量限定：患側(cè)肺受到20 Gy劑量照射體積（V20，下同）≤25%；心臟V30≤5%。所有患者胸壁射野設(shè)計時預(yù)留組織補償膜置入空間，在未來放療過程中，將10 mm 厚適形組織補償膜置入每名患者熱塑膜內(nèi)覆蓋于靶區(qū)上，以提高靠近皮膚靶區(qū)劑量（6 MeV 電子線建成深度為1.5 cm，加10 mm 組織補償膜后最大劑量點落于皮下5 mm 深度，所有患者在電子線由表皮貫穿真皮路徑上照射劑量相同，吸收劑量因放療前皮膚組織密度誤差而略有差異，但影響較小可忽略不計）。在患者每次放療前，于胸壁照射野部均勻涂抹富瑞公司醫(yī)用射線防護劑（放膚膏）以保護皮膚。

另外，于正式開始放療前，使用改進型Markus 平行板電離室（PTW 公司，德國）、1 mm厚度固體水（IBA 公司，比利時）、Harshaw 6600/8800全自動熱釋光測量工作站（賽默飛世爾公司，美國）測量所有患者標(biāo)準(zhǔn)放療條件下，單次照射220 cGy 后，皮膚表面、皮下深度1.5 mm 和2.5 mm 的平均吸收劑量。結(jié)果分別為（201.25±2.21） cGy、 （209.76±1.29） cGy 和（216.38±1.48）cGy。

1.3 分組及處理

患者首次放療開始后第15 天將其隨機均分到對照組和實驗組中。對照組采用常規(guī)護理和防治方法：要求患者著寬松衣物，減少與皮膚摩擦；避免進入高溫環(huán)境或接受低溫刺激；用75%生理鹽水清洗照射野部皮膚，2 次/d，禁止使用一切皮膚刺激性藥物；若出現(xiàn)瘤癢、脫屑、脫皮，則嚴(yán)禁抓撓、撕扯，可用溫?zé)崦磔p輕拍打止癢［6］。實驗組在對照組基礎(chǔ)上增加LED 照射：患者于放療后6 h，采用奇致公司的ML‐1201 LED光波治療儀照射胸壁野內(nèi)皮膚。紅光波長650 nm，功率密度30 mW/cm2，時間10 min，1 次/2 d，每周3 次，連續(xù)3周，共9次。

首次放療后第15天和全部放療結(jié)束后第21天分別根據(jù)美國腫瘤放射治療協(xié)作組（RTOG）對患者急性RD分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）［7］評價其RD分?jǐn)?shù)。

表1 急性RD評分及表現(xiàn)Table 1 Acute RD score and manifestation

1.4 組織學(xué)和基因表達分析

全部放療結(jié)束后第21 天，從每名患者胸壁野內(nèi)射野中心軸上皮膚表面處錐切取樣。錐切深度3.5 mm，貫穿表皮和真皮（胸部表皮平均深度為0.2 mm，真皮組織為2 mm），包含部分皮下脂肪組織，獲取組織樣本并均分為兩份，分別用于組織學(xué)和基因表達分析。組織學(xué)分析：樣本經(jīng)4%福爾馬林液浸泡24 h 后石蠟包埋，之后使用蘇木精‐伊 紅（Hematoxylin‐eosin， HE） 和 天 狼 猩 紅（Sirius red，SR）染色。HE 染色后，通過光學(xué)顯微鏡隨機選取玻片10 個區(qū)域觀察并定量皮膚附屬物（毛囊數(shù)）和微血管密度。SR 染色后，通過光鏡比較兩組膠原纖維分布和密度。

基因表達分析。首先提取RNA，將樣本置于生物組織研磨器（Bertin 公司，法國）中，加入1 mL Trizol 充分裂解5 min，再加入200 mL 氯仿，于4°C 環(huán)境下以12 000 r/min 離心15 min，之后將上層水相抽至15 mL新微量離心管中，加入同體積冷異丙醇以沉淀RNA，于室溫下沉淀10 min 后在4°C 環(huán)境下以12 000 r/min 離心10 min，之后棄上清液，使用1 mL 75%預(yù)冷乙醇洗滌包含RNA的沉淀物，在4°C環(huán)境下以10 000 r/min離心5 min，并棄上清液。最后，于Trizon Reagent RNA提取試劑盒（賽默飛世爾公司，美國）中加焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解樣本。采用紫外分光光度法檢測總RNA 濃度及純度，取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續(xù)實驗。取400 ng 總RNA，嚴(yán)格按照Primer Scdpt RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司，日本）說明書操作。反應(yīng)體系為：5×PrimeScfipt RT Master Mix（for Real Time）2 μL，RT Rrime for IL/10 &MMP-92 μL，總RNA 100～500 μg，補超純水至10 μL。反應(yīng)條件為40 ℃15 min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），90 ℃5 s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）。

然后，進行基因表達水平測定。以U6 為內(nèi)參，將樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并利用SYBR Premix ExTaq熒光定量PCR試劑盒（Takara公司，日本）、IL/10&MMP-9引物和SYBR Green 熒光染料，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，進行實時定量逆轉(zhuǎn)錄，其中IL/10 &MMP-9，U6 逆轉(zhuǎn)錄引物，PCR 上下游引物均由美國Sigma生物科技公司提供（表2）。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaq10 μL，IL/10 &MMP-9Pmimer (forward) 0.5，IL/10 &MMP-9Pmimer (reverse) 0.5，CDNAl，補 超 純 水 至20 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃2 min、95 ℃10 min、95 ℃15 s 和60 ℃1 min，共40 個循環(huán)。每個檢驗指標(biāo)做3 個復(fù)孔，取其均值計算。最后，通過RT‐qPCR 曲線獲得熒光達到閾值的循環(huán)數(shù)，即Ct 值，IL/10&MMP-9相對表達量計算公式為RQ=2-ΔΔCt。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0 軟件對于符合正態(tài)分布的計量資料采用±s描述，采用t檢驗對兩組差異進行統(tǒng)計學(xué)分析，以p＜0.05為差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LED防治效果

首次放療后第15天和全部放療結(jié)束后第21天兩組胸壁野皮膚RD評分均值如表3所示。

全部放療結(jié)束后第21 天實驗組患者急性RD：1.5 級6 例（60%）；2 級1 例（10%）；2.5 級2 例（20%）；3 級1 例（10%）。對照組：3 級2 例（20%）；3.5 級4 例（40%）；4 級2 例（20%）；4.5級1例（10%）；5級1例（10%）。由表3可見，實驗組評分未發(fā)生較大變化，對照組顯著升高。說明LED照射對RD具有良好防治效果。

表3 兩次RD評分Table 3 Twice RD score （± s,n=20）

表3 兩次RD評分Table 3 Twice RD score （± s,n=20）

分組Group對照組Control group實驗組Experimental group第一次評分First score 1.85±0.55第二次評分Second score 3.75±0.63 1.75±0.31 1.90±0.57

2.2 LED防治原理

同對照組相比，HE 染色后，光鏡下實驗組的皮膚附屬物和微血管密度增加，如圖1 和表4 所示。由圖1可知，同對照組相比，實驗組顯示出更密集的皮膚附屬物和微血管（藍(lán)色箭頭）。

圖1 HE染色結(jié)果：（a）對照組；（b）實驗組Fig.1 HE staining result:(a)control group;(b)experimental group

表4 兩組HE染色后比較Table 4 Comparison between two groups after HE staining (± s,n=20)

表4 兩組HE染色后比較Table 4 Comparison between two groups after HE staining (± s,n=20)

皮膚附屬物/(個?mm-2)Skin appendage微血管密度/(個?mm-2)Microvessel density對照組Control group 8.84±2.05實驗組Experimental group 11.37±1.36 p值p value 0.041 3.92±1.68 27.68±8.17 0.007

同對照組相比，SR 染色后，光鏡下實驗組顯示新生膠原纖維增加（圖2）。由圖2可知，與對照組相比，實驗組顯示出更密集的新生膠原纖維。

圖2 SR染色結(jié)果：（a）對照組；（b）實驗組Fig.2 SR staining results:(a)control group;(b)experimental group

綜合圖1～2和表4可見，LED照射有助于皮膚附屬物和微血管的生長，促進成纖維細(xì)胞增殖并產(chǎn)生膠原纖維，從組織學(xué)角度解釋了LED 防治原理。

由基因表達分析可知，同對照組相比，實驗組IL-10和MMP-9基因表達水平增加，結(jié)果如表5所示。LED 照射增強了同細(xì)胞恢復(fù)和損傷修復(fù)密切相關(guān)的IL-10和MMP-9基因表達，從基因表達角 度解釋了LED防治原理。

表5 兩組基因表達水平比較Table 5 Comparison of gene expression level between two groups (± s,n=20)

表5 兩組基因表達水平比較Table 5 Comparison of gene expression level between two groups (± s,n=20)

IL-10 MMP-9對照組(2-ΔΔCt)Control group(2-ΔΔCt)1.76±1.22 3.11±1.51實驗組(2-ΔΔCt)Experimental group(2-ΔΔCt)5.59±3.66 116.13±43.58 t值t value 5.160 2.273 p值p value 0.032 0.004

3 討論

RD是由于射線引起的皮膚黏膜炎性損傷，表現(xiàn)為可逆性的毛發(fā)脫落、皮炎、色素沉著及不可逆的皮膚萎縮，皮脂腺、汗腺的毀滅和永久性的毛發(fā)缺失，以致放射性壞死［8］。射線導(dǎo)致大量水合電子、羥基自由基、氫自由基的產(chǎn)生，同時伴隨著自由電子對DNA 鏈的撞擊，極大損傷了皮膚基底層細(xì)胞，使其分裂減少，向上運動受阻，角質(zhì)化降低，皮膚變薄。隨著放療劑量增加，基底層細(xì)胞加速凋亡，引起進一步干、濕性脫皮或壞死。為保護基底層細(xì)胞免受損傷，黑色素細(xì)胞釋放大量黑色素入血，導(dǎo)致色素沉著。汗腺和皮脂腺的破壞引起皮膚干燥、萎縮和纖維化［6］。

本實驗中，LED 照射對RD 防治效果顯著。LED 照射實驗組中患者皮膚新生膠原纖維、皮膚附屬物、微血管、IL-10和MMP-9兩種基因表達水平增加。首先，膠原纖維來自成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞在皮膚損傷修復(fù)中作用重大。LED 照射主要通過活性氧簇理論刺激了成纖維細(xì)胞分裂增殖，即紅光作用于成纖維細(xì)胞線粒體呼吸鏈中光受體，如細(xì)胞色素和內(nèi)源性卟啉，使呼吸鏈氧化還原反應(yīng)加速產(chǎn)生H2O2等活性氧簇，增強DNA合成和細(xì)胞質(zhì)活動，從而促進成纖維細(xì)胞增殖。成纖維細(xì)胞分泌大量的成纖維細(xì)胞生長因子、膠原纖維和基質(zhì)成分。成纖維細(xì)胞生長因子促進微血管生成，而膠原纖維和基質(zhì)成分與新生微血管共同形成肉芽組織，填補傷口缺損，為基底層細(xì)胞向上運動和覆蓋創(chuàng)造條件，促進了皮膚附屬物的增加。在創(chuàng)傷修復(fù)后期，成纖維細(xì)胞還通過分泌膠原酶參與修復(fù)后組織的改建。其次，LED照射增強MMP-9基因表達水平機制尚不明確。MMP-9主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，還可通過釋放血管內(nèi)皮生長因子促進微血管生成。再次，LED照射刺激了位于細(xì)胞線粒體膜上的受體（生色基團），從而增強IL-10基因表達水平。IL-10具有抑制單核巨噬細(xì)胞促進天然和特異性免疫的功能，同時增強這些細(xì)胞免疫耐受誘導(dǎo)。IL-10通過抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，從而抑制LPS 和IFN‐γ 導(dǎo)致的TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IL‐8、G‐CSF和GM‐CSF 分泌。此外，它增強抗炎性因子釋放，如IL‐1 受體拮抗劑和溶解性TNF‐α 受體同時抑制單核巨噬細(xì)胞的抗原遞呈作用［9‐10］。總之，實驗結(jié)果從分子生物學(xué)到免疫學(xué)再到組織學(xué)解釋了LED照射對RD的防治原理，再結(jié)合實際防治效果，表明LED 在乳腺癌患者治療和護理中的應(yīng)用具有重要臨床意義與價值。

同本實驗相似的結(jié)果也出現(xiàn)在其他研究中，Strouthos 等［11］在類似實驗中發(fā)現(xiàn)，LED 照射實驗組出現(xiàn)1級和3級急性RD比例分別為88%和12%，優(yōu)于對照組1 級、2 級、3 級分別為55.6%、20%、24.4%的結(jié)果。Fife 等［12］實驗也獲得了相似的結(jié)果。而且，除了乳腺癌，Peralta Mamani 等［10］還證明在頭頸部腫瘤放療中使用LED 照射可降低疼痛水平，促進患者皮膚黏膜損傷再生?？傊?，LED照射針對身體多部位急性RD均有良好防治效果。

實驗中還發(fā)現(xiàn)，LED 照射在增加成纖維細(xì)胞數(shù)量的同時，也會促使一部分成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞可加速RD病變中皮膚萎縮和纖維化。但從結(jié)果來看，成纖維細(xì)胞修復(fù)作用遠(yuǎn)大于肌成纖維細(xì)胞的纖維化作用。本實驗樣本容量較小，還需篩選更多乳腺癌或其他腫瘤患者，以優(yōu)化實驗結(jié)果。另外，LED 照射還可對皮膚中DNA 或蛋白質(zhì)的合成速率、細(xì)胞生長速率、各種酶的活性和CAMP 水平造成影響，未來實驗中需補充上述研究，以完善實驗結(jié)果。

作者貢獻說明 李丹負(fù)責(zé)醫(yī)學(xué)情報收集及文獻檢索和分析，完成論文初稿的寫作；范學(xué)武參與實驗設(shè)計；于蕾、田龍負(fù)責(zé)文獻資料的歸納與討論；胡逸民設(shè)計了實驗思路和過程，并提供了重要的實驗指導(dǎo)和文章修改指導(dǎo)。全體作者都閱讀并同意最終的文本。