范亦菲， 郭 琳， 靳文會， 丁玘穎， 馮雨萌，信晶晶， 董祥暉， 段文慧， 劉 蕾， 耿 燕*

（1. 江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

枸杞為茄科植物，屬多年生落葉小灌木[1]，其果實含有豐富的營養(yǎng)成分，如胡蘿卜素、甜菜堿、膳食纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸以及多種微量元素等[2]。 據(jù)《本草綱目》記載，枸杞具有去疲勞、養(yǎng)肝、明目、抗衰老功效，可令人長壽。 酸奶及相關(guān)產(chǎn)品是世界上最常見的消費(fèi)食品，目前市場常見的酸奶包括果味酸奶、紅棗酸奶等[3]，基本屬于從改善酸奶風(fēng)味角度進(jìn)行的產(chǎn)品創(chuàng)新研發(fā)。 其他的研究也包括一些真菌多糖發(fā)酵酸奶[4]，但目前關(guān)于枸杞發(fā)酵酸奶的報道較少。

作者將枸杞原漿添加到酸奶中發(fā)酵，通過體外測定添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶的總抗氧化還原能力[5]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率[6]和羥自由基清除率[7]，以及在動物體內(nèi)試驗中對小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （Cereal third transaminase，ALT）活性、肝臟中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）含量和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）質(zhì)量摩爾濃度[8]和總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）[9]進(jìn)行檢測，以期為保肝功能導(dǎo)向的枸杞發(fā)酵乳制品的后續(xù)開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

枸杞原漿： 寧夏華寶枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品；全脂牛奶：內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司產(chǎn)品；酸奶發(fā)酵劑（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）：安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品；白砂糖：安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品；鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、維生素C、DPPH、乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、H2O2溶液：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；ALT 試劑盒、LPS試劑盒、GSH 試劑盒、T-AOC 試劑盒：上海泰坦科技股份有限公司產(chǎn)品。

酸奶發(fā)酵機(jī)： 河南星樂斯美電器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海越眾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DF110型電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；CT15RE 臺式冷凍離心機(jī)：日本日立公司產(chǎn)品。

C57BL/6 小鼠： 南京集萃藥康生物科技有限公司提供。

1.2 枸杞酸奶制備

取5 個一次性發(fā)酵袋，標(biāo)號為1～5，各加入100 mL 的全脂牛奶和6 g 白砂糖。 1 號作為空白對照不加入枸杞原漿，2、3、4、5 號分別添加體積分?jǐn)?shù)2%、4%、8%、10%的枸杞原漿。 對5 組樣品進(jìn)行混勻，在40～50 ℃進(jìn)行加熱攪拌[10]。 巴氏滅菌法對所有樣品進(jìn)行滅菌處理， 控制溫度不超過80 ℃， 滅菌30 min。 待溫度冷卻到40～45 ℃之后，向5 組樣品中各加入0.1 g 發(fā)酵劑，將所有樣品放置在42 ℃的發(fā)酵機(jī)內(nèi)發(fā)酵6.5 h，后熟24 h[11]。

1.3 枸杞酸奶體外抗氧化活性測定

分別稱取發(fā)酵后添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶5.0 g， 于離心機(jī)4500 r/min 離心10 min，取上清液備用[12]。

1.3.1 總抗氧化還原能力測定 用鐵氰化鉀法檢測總抗氧化還原能力。 取枸杞酸奶上清液0.25 mL，先后向其中加入pH 6.6 的0.5 mL 磷酸緩沖液，0.5 mL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液，混勻，置于50 ℃水浴20 min 后流水冷卻。 再加入0.5 mL 的體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液， 充分混勻，5000 r/min 離心20 min，取上清液90 μL 于96 孔板中，加入90 μL純化水以及20 μL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化鐵溶液，混勻靜置10 min，于700 nm 測定吸光度，以超純水為空白，用VC 做陽性對照[13]。 每個樣品設(shè)3 組平行。

1.3.2 DPPH 自由基清除率測定 取添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶上清液20 μL， 向其中加入180 μL 的0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液， 避光室溫反應(yīng)30 min，于517 nm 處測其吸光度，記為AS；取20 μL 超純水， 向其中加入180 μL 的DPPH 乙醇溶液，其吸光度記為A0；取添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶上清液20 μL，向其中加入180 μL乙醇，其吸光度記為AC。 每個樣品設(shè)3 組平行[14]，測定DPPH 自由基清除率（I）。

1.3.3 羥自由基清除率的測定 取50 μL 添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶上清液， 加入50 μL 的9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液， 混勻后加入50 μL 的9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液和50 μL 的9 mmol/L 的H2O2溶液，充分混勻后靜置30 min 并測定混合液在510 nm 處吸光度[15]，記為AS1；取超純水為空白對照，其吸光度記為A01。 每個樣品設(shè)3 組平行，測定羥自由基清除率（Q）。

1.4 枸杞酸奶的動物評價

將25 只 體 質(zhì) 量 為18 ～22 g、5 周 齡 的 雌 性C57BL/6 小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分成正常對照組、模型組、陽性對照組、酸奶組和枸杞酸奶組，均以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，無菌水供其自由飲用。 其中陽性對照組每日以10 μL/g（以小鼠體質(zhì)量計）灌胃聯(lián)苯雙酯，酸奶組每日以10 μL/g（以小鼠體質(zhì)量計）灌胃不加枸杞原漿的酸奶，枸杞酸奶組每日以10 μL/g（以小鼠體質(zhì)量計）灌胃添加體積分?jǐn)?shù)10%枸杞原漿的枸杞酸奶；正常對照組第14 天晚上以10 μL/g（以小鼠體質(zhì)量計）灌胃無菌水，模型組、陽性對照組、酸奶組和枸杞酸奶組第14 天晚上以一次經(jīng)口灌胃乙醇0.012 mL/g（相當(dāng)于4800 mg/kg，以小鼠體質(zhì)量計）。第15 天采用體積分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉溶液對小鼠進(jìn)行腹腔注射，使其麻醉。 小鼠眼球取血置于離心管中，4 ℃靜置30 min 后，4000 r/min 離心15 min，取上清液得到血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩］o以二氧化碳安樂死，繼而對小鼠進(jìn)行解剖取肝臟組織裝于1.5 mL 的EP 管中液氮急凍后，于-80 ℃冰箱保存。 按照試劑盒說明書方法檢測小鼠肝臟中ALT 活性、LPS 含量、GSH 質(zhì)量摩爾濃度[16]和總抗氧化能力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 和Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理與作圖分析，統(tǒng)計方法采用t 檢驗分析進(jìn)行組間比較，*P＜0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞酸奶體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.1.1 總抗氧化還原能力測定 以維生素C（Vitamin C，VC）為標(biāo)準(zhǔn)品建立VC 質(zhì)量濃度與總抗氧化還原能力吸光度之間的關(guān)系， 得回歸方程y=4.5174x＋0.0782（R2=0.9936），線性良好，可用于衡量各樣品中的總抗氧化還原能力（每100 g 酸奶中所含VC 的質(zhì)量）[17]。

由圖1 可見， 添加體積分?jǐn)?shù)2%～8%枸杞原漿的枸杞酸奶同未加枸杞原漿的原味酸奶相比，其總抗氧化還原能力有極顯著地提高，且有劑量依賴性（***P＜0.001）。但添加體積分?jǐn)?shù)10%枸杞原漿的枸杞酸奶與添加體積分?jǐn)?shù)8%枸杞原漿的枸杞酸奶相比，其總抗氧化還原能力升高并不顯著（*P＞0.05）?？傊?，在枸杞原漿添加一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，枸杞酸奶總抗氧化還原能力隨枸杞原漿添加體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，即枸杞酸奶的總抗氧化還原能力隨枸杞原漿添加體積分?jǐn)?shù)的增加而增加[18]。

圖1 添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶對總抗氧化還原能力的影響Fig. 1 Effect of different content of Lycium barbarum yogurt on total antioxidant reduction capacity

2.1.2 DPPH 自由基清除率測定 由圖2 可見，添加體積分?jǐn)?shù)2%～10%枸杞原漿的枸杞酸奶同未加枸杞原漿的原味酸奶相比，其DPPH 自由基清除率均有很顯著提高（**P＜0.01），表明添加了枸杞原漿的枸杞酸奶其DPPH 自由基清除能力顯著強(qiáng)于未加枸杞原漿的原味酸奶[19]。 添加體積分?jǐn)?shù)10%枸杞原漿的枸杞酸奶與添加體積分?jǐn)?shù)2%、4%枸杞原漿的枸杞酸奶相比，其DPPH 自由基清除率也顯著升高（*P＜0.05）。 在枸杞原漿添加一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，DPPH 自由基清除率隨枸杞添加體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；當(dāng)枸杞原漿添加體積分?jǐn)?shù)為10%時，DPPH 自由基清除率高達(dá)87.52%。

圖2 添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶對DPPH 自由基清除率的影響Fig. 2 Effect of different content of Lycium barbarum yogurt on the scavenging rate of DPPH free radicals

2.1.3 羥自由基清除率的測定 由圖3 所示，添加體積分?jǐn)?shù)2%、4%枸杞原漿的枸杞酸奶同未加枸杞原漿的原味酸奶相比，其羥自由基清除率均有很顯著地提高（**P＜0.01）；添加體積分?jǐn)?shù)8%、10%枸杞原漿的枸杞酸奶比原味酸奶的羥自由基清除率有極為顯著地提高（***P＜0.001），表明添加枸杞原漿的枸杞酸奶其羥自由基清除能力均顯著強(qiáng)于未加枸杞原漿的原味酸奶[20]。其中，添加體積分?jǐn)?shù)10%枸杞原漿的枸杞酸奶與添加體積分?jǐn)?shù)2%～8%枸杞原漿的枸杞酸奶相比， 其羥自由基清除率升高也很顯著（**P＜0.01）。 在枸杞原漿添加一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，羥自由基清除率隨枸杞原漿添加體積分?jǐn)?shù)的增加而增加[21]；當(dāng)枸杞原漿添加體積分?jǐn)?shù)為10%時，羥自由基清除率可達(dá)76.45%。

圖3 添加不同體積分?jǐn)?shù)枸杞原漿的枸杞酸奶對羥自由基清除率的影響Fig. 3 Effect of different content of Lycium barbarum yogurt on hydroxyl radical scavenging rate

2.2 枸杞酸奶的動物評價結(jié)果

2.2.1 小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性檢測結(jié)果谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)濃度比血清中高1000～3000 倍。僅有體積分?jǐn)?shù)為1%的肝細(xì)胞被破壞，就可以使血清中酶含量增高一倍。 因此，小鼠血清中ALT 活性作為小鼠肝功能損傷的重要檢測指標(biāo)。 由圖4 可知，急性酒精性肝損傷模型組小鼠血清ALT 活性較正常對照組顯著升高 （*P＜0.05），為乙醇導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷所致。與模型組比較，陽性對照組的血清ALT 活性顯著降低（*P＜0.05）。枸杞酸奶組與模型組相比，其血清中ALT 活性下降較明顯，顯示枸杞酸奶可能會對急性酒精性肝損傷小鼠的肝臟有一定的保護(hù)作用。

圖4 枸杞酸奶對急性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT 活性的影響Fig. 4 Effect of Lycium barbarum yogurt on serum ALT level in mice with acute alcoholic liver injury

2.2.2 小鼠肝臟中脂多糖 （LPS） 含量檢測結(jié)果LPS 可誘導(dǎo)急性肝損傷的發(fā)生。由圖5 可知，急性酒精性肝損傷模型組小鼠肝臟中LPS 含量較陽性對照組有所升高。 與正常對照組和模型組相比，枸杞酸奶組的LPS 含量略降低。 需要注意的是，與模型組相比，酸奶組的LPS 含量有略微升高，可能是由于酸奶中脂肪含量較高。 但枸杞酸奶組與酸奶組相比，其肝臟中LPS 含量顯著下降，表明枸杞作為功能成分添加到發(fā)酵酸奶中有可能會通過降低LPS含量從而影響急性酒精性肝損傷程度。

圖5 枸杞酸奶對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟中LPS 含量的影響Fig. 5 Effect of Lycium barbarum yogurt on LPS level in liver of mice with acute alcoholic liver injury

2.2.3 小鼠肝臟中谷胱甘肽（GSH）質(zhì)量摩爾濃度的檢測結(jié)果 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合，含有巰基的三肽，由于谷胱甘肽本身的解毒和抗氧化能力，使得谷胱甘肽具有重要的保肝護(hù)肝作用[22]。 由圖6 可知，與正常對照組比較，酸奶組和枸杞酸奶組的GSH 質(zhì)量摩爾濃度均顯著提高（*P＜0.05）， 其中枸杞酸奶組的GSH 質(zhì)量摩爾濃度比酸奶組的升高更為明顯，表明枸杞酸奶很可能通過提高肝臟中GSH 質(zhì)量摩爾濃度從而提高小鼠肝臟的抗氧化能力。

圖6 枸杞酸奶對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟中GSH 質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig. 6 Effect of Lycium barbarum yogurt on GSH content in liver of mice with acute alcoholic liver injury

2.2.4 小鼠肝臟總抗氧化能力（T-AOC）檢測結(jié)果總抗氧化能力越強(qiáng)，肝臟損傷程度越小。 由圖7 可知，與模型組相比，枸杞酸奶組的肝臟T-AOC 值有所提高，表明枸杞酸奶可能會提高肝臟總抗氧化能力[23]。

圖7 枸杞酸奶對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟總抗氧化能力的影響Fig. 7 Effect of Lycium barbarum yogurt on total antioxidant capacity in liver of mice with acute alcoholic liver injury

3 結(jié)語

作者將枸杞原漿作為功能成分添加到酸奶中進(jìn)行發(fā)酵， 在枸杞原漿添加一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，枸杞酸奶總抗氧化還原能力、DPPH 自由基清除率和羥自由基清除率均隨枸杞原漿添加體積分?jǐn)?shù)的增加而增加； 當(dāng)枸杞原漿添加體積分?jǐn)?shù)為10%時，其總抗氧化還原能力為2.81 mg/hg （以酸奶質(zhì)量計），DPPH 自由基清除率高達(dá)87.52%，羥自由基清除率可達(dá)76.45%。 在動物體內(nèi)試驗中，枸杞酸奶可以降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，降低肝臟中脂多糖（LPS）的含量，提升肝臟的總抗氧化能力 （T-AOC）， 并且可顯著提高肝臟中谷胱甘肽（GSH）的質(zhì)量摩爾濃度，因此枸杞酸奶可能對乙醇引起的急性肝損傷具有輔助保護(hù)作用。 綜上所述，枸杞酸奶表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化活性和一定的肝臟保護(hù)功能，可為日后開發(fā)出具有解酒保肝功能的枸杞發(fā)酵乳制品提供一定的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。