董 晨,李金枝,鄭雪文,王 弋,李偉才
(中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所/農業(yè)農村部熱帶果樹生物學重點實驗室,廣東 湛江 524091)
【研究意義】荔枝(Litchi chinensisSonn.)是嶺南名貴水果,有“嶺南果王”之美譽。荔枝是典型的糖直接積累型果實,含糖量是優(yōu)質荔枝品種的重要指標之一。不同荔枝品種積累的主要糖分不同,如妃子笑和黑葉荔枝以積累還原糖為主,無核荔和糯米糍荔枝則以積累蔗糖為主[1]。不同品種荔枝的糖分構成不同,其實質是不同酶系統(tǒng)調控的結果,而酶系統(tǒng)及其活性與基因表達相關[2]。蔗糖代謝相關酶活性與蔗糖積累密切相關,而轉化酶是調節(jié)蔗糖代謝的關鍵酶之一,轉化酶將蔗糖分解為還原糖和果糖,在蔗糖的轉運、貯藏和分配中起重要作用[3]。根據最適pH 值,轉化酶可分酸性轉化酶(AI)和堿性轉化酶(NI);根據定位,酸性轉化酶又分為可溶性酸性轉化酶(SAI)和細胞壁酸性轉化酶(CWAI)[4]??扇苄运嵝赞D化酶是一種液泡酶,能調控液泡的庫活力,對外界脅迫、激素和細胞伸長等都有一定作用[5-9];細胞壁酸性轉化酶主要參與韌皮部質外體卸載時蔗糖的分解,以保持庫-源之間蔗糖的濃度梯度,在調控植物衰老及果實發(fā)育中起重要作用[10]。
【前人研究進展】酸性轉化酶能顯著調控果實成熟期的糖組分。如在香蕉果實成熟過程中酸性轉化酶能顯著調節(jié)蔗糖與還原糖的比值[11];菠蘿蜜果實發(fā)育過程中,隨著轉化酶活性增強,蔗糖含量隨之減少,且不同品種中轉化酶活性存在差異[12-13]。在葡萄、荔枝、甘蔗等作物中,轉化酶基因表達量越高,轉化酶活性越高,伴隨著蔗糖含量越少且還原糖含量升高,反之亦然[14-15]。研究表明,以積累蔗糖為主的糯米糍等荔枝在果實成熟過程中幾乎檢測不到酸性轉化酶活性,而積累還原糖為主的妃子笑等則保持較高的酸性轉化酶活性[16]。還原糖積累型果實酸性轉化酶基因的表達量顯著上調,而在蔗糖積累型果實中該基因表達量很低。【本研究切入點】基因表達由上游調控因子調節(jié),啟動子決定特定基因的表達。因此,克隆并分析酸性轉化酶基因的啟動子,對深入了解荔枝不同糖積累類型的調控機理具有重要意義。但目前尚未見有關荔枝酸性轉化酶基因LcSAI啟動子的相關報道?!緮M解決的關鍵問題】本研究通過克隆荔枝LcSAI啟動子,利用生物信息學分析工具對LcSAI啟動子中可能的轉錄起始位點、順式作用元件、CpG 島等進行分析,以期為今后深入研究荔枝生產中的品質調控提供理論基礎。
供試荔枝品種為妃子笑,2021 年5 月下旬采自中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所荔枝種植園,取成熟妃子笑果肉作為基因組DNA 的提取材料。
DNA 提取試劑盒Easypure Plant Genomic DNA Kit、pEASY-T1 載體和大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術有限公司。所用儀器主要有Eppendorf 離心機、Germany 超微量分光光度計、Thermo Fisher Scientific PCR 儀。
1.2.1 基因組DNA 提取 按照DNA 提取試劑盒說明書的方法提取荔枝基因組DNA。取2 μL 得到的DNA 檢測質量和濃度,樣品符合要求后放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 引物設計 基于荔枝基因組數據庫,查找LcSAI基因上游2000bp的片段,設計上、下游引物,引物序列LcSAIpFw:5′TCTTCAACCTTGAACCATGACCT3′,LcSAIpRe:5′CCGGCAAGGGAGTGTAGTAT3′,引物委托廣州艾基生物有限公司合成。
1.2.3 LcSAI 啟動子克隆 以妃子笑DNA為模板,PCR 擴增LcSAI啟動子序列。PCR 反應體系:2×PCR buffer 25 μL,dNTP(2 mmol/L)10 μL,上下游引物各2μL,DNA模板1μL,KOD 酶1μL,用ddH2O 補足50 μL。PCR反應程序:94 ℃ 2min,98 ℃ 10 s、68 ℃ 2.5 min、68 ℃7 min,35 個循環(huán)。經0.5%TBE 瓊脂凝膠電泳,獲得特異性目的條帶,進行切膠回收,將回收產物連接至pEASY-T1 載體,轉入大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞,于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),隨機挑取15 個單菌落進行菌落PCR 鑒定,挑取3 個陽性克隆菌液送至廣州艾基生物技術有限公司測序。
1.2.4LcSAI啟動子生物信息學分析 利用在線軟件BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測LcSAI啟動子轉錄起始位點及可能的核心啟動子區(qū)域;啟動子順式作用元件利用在線分析工具PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測;啟動子CpG 島利用在線軟件CpG Island Searcher(http://www.cpgislands.com)預測,預測時用1 個長度為200 bp 的窗口移過序列,每次移1 個堿基對,計算Y 值(實際值/期望值),CpG 島定義為Y>0.6 且GC 含量>50%的200 bp 序列區(qū)域。
以妃子笑基因組DNA 為模板,LcSAIpFw、LcSAIpRe 為引物,擴增出長約1 000~2 000 bp 的單一條帶,與預測目的條帶大小吻合(圖1)。將PCR 產物純化回收后連接至pEASY-T1 載體,轉入大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞,經培養(yǎng)后進行菌液PCR 鑒定(圖2),陽性克隆菌液經測序,結果顯示獲得1 514 bpLcSAI基因啟動子序列。
圖1 LcSAI 基因啟動子克隆結果Fig.1 Cloning of LcSAI gene promoter
圖2 菌液PCR 檢測結果Fig.2 PCR detection of bacterial liquid
利用在線軟件BDGP 對LcSAI基因啟動子的轉錄起始位點進行預測,LcSAI可能存在3 處核心啟動子區(qū)域,分別位于276~326、458~508、1 183~1 233 bp,分值分別為0.94、0.82 和0.83,可能的轉錄起始位點分別為C、A、A(表1)。根據結果可推測位于276~326 bp 的序列很可能就是該基因真正的核心啟動子區(qū)域,轉錄起始位點為位于第316 bp 的C。
表1 LcSAI 基因啟動子核心啟動子區(qū)域Table 1 Core promoter region of LcSAI gene promoter
利用在線軟件PlantCARE 對LcSAI基因啟動子順式作用元件進行預測,結果(圖3)顯示,LcSAI啟動子序列除了存在大量的啟動子核心元件如TATA-box 和增強元件CAAT-box 外,還存在多種特殊順式元件,如光響應順式元件、植物激素應答元件、MYB 結合位點、MYC 結合位點及一些未知功能元件。
圖3 LcSAI 基因啟動子序列及其關鍵元件Fig.3 Promoter sequence of LcSAI gene and its key elements
由表2可知,LcSAI啟動子中含有35 個TATA-box 核心啟動元件、38 個CAAT-box 增強元件,多種光響應元件和植物激素應答元件。光響應元件有5 種,分別為3-AF1 binding site、ATCT-motif、Box 4、G-box 和TCT-motif,其 中G-box 數量最多、有8 個,ATCT-motif 有4 個,Box 4 有2 個,3-AF1 binding site 和TCT-motif 各1 個。在植物激素響應元件中,LcSAI啟動子含有茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif 和TGACGmotif 各2 個,赤霉素響應元件TATC-box 和水楊酸響應元件TCA-element 各1 個,脫落酸響應元件 ABRE 有5 個。
表2 LcSAI 啟動子序列所含順式作用元件Table 2 Cis-acting elements in LcSAI promoter sequence
CpG 島作為表觀調控的重要組成部分,在基因調控方面起重要作用。通過在線CpG 島預測軟件CpG Island Searcher 對LcSAI啟動子序列進行CpG 島預測。預測結果顯示,在LcSAI基因啟動子區(qū)沒有符合限定條件的CpG 島,這可能與獲得的序列長度有關。
可溶性酸性轉化酶定位在植物體液泡中,催化蔗糖水解為己糖,在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。以積累己糖為主的葡萄果實中,在果實發(fā)育全過程中酸性轉化酶活力均維持較高水平[17]?;虮磉_水平是由基因上游的啟動子順式作用元件及轉錄因子共同調控。啟動子中包括多種順式作用元件,如上游啟動子元件、核心啟動子元件、特殊啟動子元件、遠端上游元件等。其中在植物逆境脅迫誘導基因表達起關鍵作用為特殊啟動子元件[18]。本研究通過克隆妃子笑酸性轉化酶LcSAI啟動子,采用生物信息學方法對LcSAI啟動子的轉錄起始位點、順式作用元件及CpG 島進行在線預測,分析結果表明LcSAI啟動子片段轉錄起始位點為在核心啟動子區(qū)域第316 bp 的C。LcSAI啟動子區(qū)沒有預測到符合限定條件的CpG 島,可能與獲得序列長度不同有關。
對啟動子結構和順式元件的探索不僅有助于更好地調節(jié)單個或多個異源基因響應化學、生物以及環(huán)境因素刺激,而且為研究者改良作物提供了新思路,從而開啟了設計啟動子的新領域[19]。??∑娴龋?0]對甘蔗可溶性酸性轉化酶基因及部分啟動子進行克隆和序列分析發(fā)現,SoSAI1基因啟動子在甘蔗生長發(fā)育和蔗糖積累并在應對環(huán)境脅迫中發(fā)揮作用。本研究表明,荔枝LcSAI啟動子序列包含核心啟動元件TATA-box 35 個和CAAT-box 38 個。其中核心啟動元件TATA-box有介導基因轉錄的作用,普遍存在于真核生物啟動子上,含有TATA-box 的基因對轉錄調控比較敏感[21]。核心啟動元件CAAT-box 可增強啟動子的強度,原因是因為CAAT-box 對轉錄起始的頻率具有一定影響。此外,妃子笑LcSAI的啟動子中還包含多種特殊啟動子元件,如光響應元件(3-AF1 binding site、ATCT-motif、Box 4、G-box、TCT-motif)和植物激素響應元件(ABRE 脫落酸響應元件、CGTCA-motif、TGACG-motif 茉莉酸甲酯響應元件、TATC-box 赤霉素響應元件、TCAelement 水楊酸響應元件)。后續(xù)將對植物激素應答元件與轉錄因子結合調控LcSAI基因的表達進行深入研究。
本研究以妃子笑荔枝為材料,克隆得到1 514 bpLcSAI啟動子片段,LcSAI啟動子片段轉錄起始位點可能存在3 處核心啟動子區(qū)域。根據得分,位于276~326 bp 的序列很可能為LcSAI啟動子真正的核心啟動子區(qū)域,轉錄起始位點為位于第316 bp 的C。LcSAI基因的啟動子序列包括35 個TATA-box、38 個CAAT-box 核心啟動元件以及多種特殊啟動子元件,如多種光響應元件和植物激素響應元件。LcSAI基因啟動子共含有近30 種順式作用元件,意味著LcSAI具有復雜的表達調控機制,順式作用元件與相應的反式作用因子相互作用發(fā)揮生物學功能。