李甜子，鄭雪文，曹新玥，陳嘉華，楊轉(zhuǎn)英

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】火龍果（Hylocereus undulatusBritt）屬仙人掌科量天尺屬或蛇鞭柱屬攀援性肉質(zhì)植物，又稱紅龍果、仙蜜果等。根據(jù)外觀和果肉顏色，火龍果常被分為紅皮紅肉、紅皮白肉和黃皮白肉3種［1］?；瘕埞蛇m應(yīng)多種土壤，病害少，易管理，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高且市場(chǎng)潛力大，在熱帶和亞熱帶地區(qū)被廣泛種植［2］，近年種植規(guī)模不斷擴(kuò)大［3-4］?；瘕埞缓妓衔?、維生素、花青素、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)成分，以及鋅、鎂、鈣、鐵、銅等有益元素［5］，對(duì)人體有抗氧化、抗衰老、降血壓血脂等作用［6］，并且還可以調(diào)節(jié)血糖、減輕便秘，對(duì)糖尿病有非常高的輔助治療作用，是一種極具開發(fā)潛力和開發(fā)價(jià)值的新型食療保健水果［7］。因此，研究火龍果果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的形成機(jī)制，對(duì)定向調(diào)節(jié)果實(shí)品質(zhì)和推進(jìn)火龍果產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要指導(dǎo)意義。

【前人研究進(jìn)展】果實(shí)中可溶性糖的種類與含量在很大程度上影響果實(shí)的甜度和風(fēng)味品質(zhì)［8-9］。市面上優(yōu)質(zhì)火龍果普遍根據(jù)火龍果的甜度（糖的種類和含量）進(jìn)行定價(jià)。果實(shí)糖分的積累與代謝是影響果實(shí)中可溶性糖的種類與含量的主要原因，而糖分的積累、代謝與相關(guān)酶活性有著密切關(guān)系［10］。火龍果果肉中的可溶性糖以葡萄糖為主，其次是果糖和蔗糖［11］。與葡萄糖積累與代謝相關(guān)的酶有萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose trnsporte,GLUT）、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hexose transporter,HXT）等［12］。己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)甘露糖、果糖和葡萄糖等己糖類物質(zhì)［13］，在葡萄糖的積累與代謝過(guò)程中起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還參與花粉發(fā)育和植株生長(zhǎng)，并決定果實(shí)的品質(zhì)［14］。關(guān)于己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在葡萄糖積累與代謝過(guò)程中的作用，已有人對(duì)甘蔗、甜瓜和蘋果等植物進(jìn)行相關(guān)研究［15-17］。

【本研究切入點(diǎn)】目前，對(duì)于火龍果的研究大多集中在栽培、采后貯藏、營(yíng)養(yǎng)成分分析和病蟲害防治等方面［8］，對(duì)火龍果在糖代謝方面的研究則較少。探究己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在火龍果葡萄糖積累與代謝過(guò)程中的作用，有利于進(jìn)一步改善火龍果的風(fēng)味品質(zhì)，為火龍果的選育及推廣提供重要技術(shù)支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)經(jīng)基因克隆得到的火龍果己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)HLPC 測(cè)定果實(shí)中可溶性糖的種類及含量，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)不同株系火龍果、同一果實(shí)不同部位中的HXT表達(dá)量進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試火龍果來(lái)自廣東海洋大學(xué)校內(nèi)火龍果資源圃，選取健壯的15 號(hào)、16 號(hào)、49 號(hào)、97 號(hào)、128 號(hào)、紅皮白肉（HB）、湛紅2 號(hào)（ZH）株系為試驗(yàn)材料（所列火龍果編號(hào)為資源圃中對(duì)應(yīng)的編號(hào)），在成熟期分別采摘火龍果果實(shí)3～5 個(gè)，取果肉混合作為不同株系火龍果果肉樣品。將單個(gè)成熟的128 號(hào)火龍果果肉分成4 個(gè)部分，分別為近果頂、近果蒂、果心、近果皮（圖1），作為火龍果同一果實(shí)不同部位的樣品。取樣后將單個(gè)樣品充分混合，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 128 號(hào)火龍果果實(shí)取樣部位Fig.1 Sampling parts of No.128 Pitaya fruit

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 火龍果總RNA 提取 采用超快型植物總RNA 提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司），按照說(shuō)明書方法提取火龍果樣品RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量，合格RNA 置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄及HuHXT基因克隆 以火龍果樣品RNA 為模板，根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（上海純優(yōu)生物科技有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以火龍果果肉cDNA為模板克隆火龍果中HuHXT基因（引物序列為F：5′GATCTGGGTATTGCTGGCAA3′，R：5′GGCTGGGCTTAAAGCTCG3′），PCR 擴(kuò)增結(jié)果通過(guò)電泳進(jìn)行檢測(cè)，將目的基因切膠回收，純化產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，陽(yáng)性檢測(cè)合格后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用NCBI 的BLAST 分析HuHXT核酸序列的分子質(zhì)量、堿基組成與堿基同源性等；通過(guò)ORF Finder 對(duì)HuHXT核酸序列進(jìn)行開放性閱讀框分析；用BioEdit 軟件對(duì)man ORF 翻譯的蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；通過(guò)SMART進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；用NCBI 的BLASTX 分析HuHXT核酸序列，選擇合適的同源序列并下載生成fasta 文件，然后用CLUSTAL 軟件將下載的蛋白質(zhì)序列與火龍果己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列比對(duì)，再用DNAMAN 根據(jù)結(jié)果描繪出系統(tǒng)進(jìn)化樹；用Prediction Serves 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；用ExPASy 服務(wù)器的ProtScale 程序?qū)uHXT 氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析；通過(guò)TMHMM Server 進(jìn)行HXT 氨基酸序列跨膜區(qū)分析；用WoLF PSORT 對(duì)HuHXT氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位；采用NetPhos2.0 Server 程序進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析；分別通過(guò)PBIL LYON-GERLAND 信息庫(kù)的Hopfield 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和Biozentrum 的SWISS-MODEL 對(duì)HuHXT 氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.4HuHXT基因引物設(shè)計(jì)與熒光定量PCR 根據(jù)獲得的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列設(shè)計(jì)出定量PCR引物（表1），以火龍果Actin基因作為內(nèi)參、不同火龍果樣品cDNA 為模板，按照熒光定量PCR 試劑盒（瑞真生物科技有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行HuHXT基因相對(duì)表達(dá)情況分析。每個(gè)樣品設(shè)3 次重復(fù)，10 μL 反應(yīng)體系中包含SYBR Green 預(yù)混液 5 μL、超純水3 μL、Primer Mix 1 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)各樣品的Ct 值，利用2-ΔΔCt法計(jì)算HuHXT的相對(duì)表達(dá)量。

表1 火龍果HuHXT 基因表達(dá)引物Table1 Primers for HuHXT gene expression of pitaya

1.2.5 可溶性糖含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取火龍果果肉1 g，放入研缽后在微波爐中殺酶40 s，加入2 mL超純水勻漿，再用2 mL 超純水清洗研缽2～3 次，合并提取液后定容至10 mL，12 000 r/min 離心15 min，取1 mL 經(jīng)C18柱過(guò)濾后待測(cè)。設(shè)4 次取樣，2 次重復(fù)。使用美國(guó)Agilent 1100LC 高效液相色譜儀，配有RID 示差檢測(cè)器，色譜柱為Coregel 87C（Transgenomic CHO-99-5860），流動(dòng)相為過(guò)濾超純水，流速為1 mL/min，柱溫為80 ℃，進(jìn)樣量10 μL，所用標(biāo)樣為分析純的蔗糖、葡萄糖和果糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果總RNA 提取及HuHXT 基因克隆

本研究從火龍果果肉中提取的總RNA 質(zhì)量較高，電泳條帶清晰，完整性較好（圖2A），可以用來(lái)合成第一鏈cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴(kuò)增HuHXT基因全長(zhǎng)序列，經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)其長(zhǎng)度約為1 200 bp（圖2B）。

圖2 火龍果RNA（A）和擴(kuò)增的HuHXT基因片段（B）電泳結(jié)果Fig.2 Gel electrophoresis of pitaya RNA (A) and amplified HuHXT gene fragment (B)

2.2 HuHXT 的生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因序列比對(duì)分析 經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)HuHXT全長(zhǎng)1 230 bp（圖3），其中腺嘌呤266 個(gè)、占21.6%，胞嘧啶251 個(gè)、占20.4%，鳥嘌呤324 個(gè)、占26.3%，胸腺嘧啶389 個(gè)、占31.6%。單鏈DNA分子量380.65 ku，雙鏈DNA 分子量758.26 ku。

圖3 HuHXT 開放閱讀框及其編碼氨基酸Fig.3 HuHXT open reading frame and its encoded amino acids

利用BioEdit 軟件對(duì)HuHXT 氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。HuHXT 開放閱讀框編碼410 個(gè)氨基酸，其中強(qiáng)堿性氨基酸（K、R）22 個(gè)，強(qiáng)酸性氨基酸（D、E）18 個(gè)、疏水氨基酸（A、F、I、L、V、W）165 個(gè)、不帶電荷極性氨基酸（C、N、Q、S、T、Y）79 個(gè)，分子量為36 441.08 u，等電點(diǎn)為8.86，分子式為C1672H2666N414O458S17，原子總量為5 227，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為35.59，可見HuHXT 蛋白為穩(wěn)定性蛋白。

經(jīng)NCBI 同源性分析可知，火龍果HuHXT 與甜菜、煙草等HXT 同源性較高，用DNAMAN 進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）顯示，火龍果HuHXT 蛋白與甜菜、菠菜、藜麥的HXT 蛋白歸在一類。

圖4 HuHXT 同源比對(duì)進(jìn)化樹Fig.4 HuHXT homology comparison evolutionary tree

2.2.2 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 信號(hào)肽是指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移（定位）的N-末端短肽鏈［18］。由圖5 可知，HuHXT 第1～34 位之間有信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)，并且表現(xiàn)為非分泌型蛋白。

圖5 HuHXT 信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of HuHXT signal peptide

2.2.3 疏水性分析 由圖6 可知，HuHXT 氨基酸鏈的第109 號(hào)亮氨酸（Leu）有最高分值（3.311），疏水性最強(qiáng)；第398 號(hào)異亮氨酸（Ile）有最低分值（-1.778），親水性最強(qiáng)。其平均疏水性為0.770，整體親水性小于疏水性，表明HuHXT蛋白為疏水蛋白。

圖6 HuHXT 疏水性分析Fig.6 Hydrophobicity analysis of HuHXT

2.2.4 跨膜區(qū)分析 經(jīng)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示，HuHXT 存在于生物膜上，包括細(xì)胞膜、質(zhì)膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（膜）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（管腔）中。通過(guò)跨膜區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，HuHXT 明顯位于跨膜區(qū)，其可能是細(xì)胞膜的組成或者膜上的受體［19］。該氨基酸序列長(zhǎng)度為410，預(yù)測(cè)TMH 數(shù)量為9 個(gè)，TMH 中AAs 的Exp 數(shù)為217.70234，前60 個(gè)AAs的Exp 數(shù)為26.16762，N-in 的總概率為0.59011%。

圖7 HuHXT 蛋白跨膜區(qū)分析Fig.7 Analysis of transmembrane region of HuHXT protein

2.2.5 磷酸化位點(diǎn)分析 蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍和最重要的機(jī)制，是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式［20］。由磷酸化位點(diǎn)的分析結(jié)果（圖8）可知，HuHXT有15 個(gè)Thr、15 個(gè)Tyr、32 個(gè)Ser，可能成為蛋白激酶的結(jié)合位點(diǎn)，由蛋白質(zhì)激酶催化的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（Thr、Tyr、Ser）上，或者在信號(hào)作用下結(jié)合GTP。

圖8 HuHXT 磷酸化位點(diǎn)分析Fig.8 Phosphorylation site analysis of HuHXT

2.2.6 HuHXT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 由圖9可知，HuHXT序列編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要以α-螺旋、不規(guī)則盤繞和延伸鏈構(gòu)成大體蛋白結(jié)構(gòu)，β-折疊散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。該蛋白除了有Sugar_tr 結(jié)構(gòu)域外，還含有SP、xylE、2A0119、MFS、2A0115、synapt_SV2、2A0112、2A0109、2A0106、MFS_1 等多個(gè)結(jié)合域，主要進(jìn)行糖的運(yùn)輸，轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合蛋白、碳水化合物、有機(jī)醇和酸、陽(yáng)離子以及攜帶鐵的化合物，也可臨時(shí)做D-木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白XylE、突觸小泡蛋白SV2，促進(jìn)多種底物（包括離子、糖磷酸鹽、藥物、神經(jīng)遞質(zhì)、核苷、氨基酸和肽）的細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖9 HuHXT 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of secondary structure of HuHXT protein

2.2.7 HuHXT 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬 模擬HuHXT蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)可得到圖10 的兩個(gè)模型，其中模型A 為溶質(zhì)載體家族2（促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）成員3，序列相似范圍為15～408，覆蓋率達(dá)到95%；模型B 為H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，序列相似范圍為2～397，覆蓋率達(dá)到94%。

圖10 HuHXT 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬Fig.10 Prediction of tertiary structure of HuHXT protein

2.3 HuHXT 基因表達(dá)分析

對(duì)火龍果7 個(gè)株系和同一果實(shí)不同部位中的可溶性糖組分、含量及HuHXT基因表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，火龍果果實(shí)中的可溶性糖主要有蔗糖、葡萄糖和果糖3 種，以葡萄糖和果糖為主，不同株系中可溶性糖含量不同，16 號(hào)和128號(hào)株系較高，葡萄糖、果糖平均含量為70.20、63.30 mg/g 和66.90、57.50 mg/g。ZH 株系最低，葡萄糖、果糖平均含量為僅24.12、19.73 mg/g（圖11A）；同一果實(shí)不同部位的糖含量也不同，其中靠近果皮部位最低、葡萄糖含量為43.87 mg/g，果心部位最高、葡萄糖含量可達(dá)89.36 mg/g（圖11B）。HuHXT基因在不同株系中表達(dá)量存在顯著差異，其中97 號(hào)株系的表達(dá)量最高，極顯著高于其他6 個(gè)株系，HB 和128 號(hào)株系的表達(dá)量差異不顯著，49 號(hào)、15 號(hào)和16 號(hào)株系的表達(dá)量相對(duì)較低（圖12A）。在同一果實(shí)不同部位中HuHXT表達(dá)量差異不顯著，在靠近果皮部位表達(dá)量最高，近果頂和果蒂處表達(dá)量較低（圖12B）。由圖13可知，不同株系和部位火龍果果實(shí)中的葡萄糖含量與HuHXT 水平存在負(fù)線性相關(guān)關(guān)系，即還原糖含量較高的株系或部位HuHXT表達(dá)量相對(duì)較低，具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

圖11 不同株系（A）和不同部位（B）火龍果果實(shí)的可溶性糖組分含量比較Fig.11 Comparison of soluble sugar contents in pitaya fruits of different lines (A) and different parts (B)

圖12 不同株系（A）和不同部位（B）火龍果果實(shí)的HuHXT 表達(dá)量比較Fig.12 Comparison of HuHXT expression in pitaya fruits of different lines (A) and different parts (B)

圖13 不同株系（A）和不同部位（B）火龍果果實(shí)的葡萄糖含量與HuHXT 表達(dá)量的相關(guān)分析Fig.13 Correlation analysis of glucose content and HuHXT expression in pitaya fruits of different lines (A) and different parts (B)

3 討論

本研究 從火龍果中克隆得到1 個(gè)編碼己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HuHXT，該基因長(zhǎng)度為1 230 bp，開放閱讀框編碼410 個(gè)氨基酸，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。通過(guò)生物信息學(xué)分析可知，HuHXT為單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的成員，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白，位于生物膜上，其氨基酸序列與菠菜和甜菜HXT4 的同源性均達(dá)到88%以上。推測(cè)火龍果中HXT也是一個(gè)基因家族，HuHXT是其中一個(gè)與菠菜和甜菜HXT4 功能相似的基因成員。

果實(shí)中糖組分及含量是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素，魏曉鈺等［15］將蘋果己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdHT2.2克隆到番茄植株，發(fā)現(xiàn)MdHT2.2過(guò)量表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因克隆番茄株系葉片中的葡萄糖含量。張清等［16］在甘蔗己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族基因演化與表達(dá)分析研究中發(fā)現(xiàn)，甘蔗己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HXT2、HXT8、HXT12、HXT13在甘蔗材料苗期的葉子、成熟期的莖和葉中均高度表達(dá)，在甘蔗己糖裝載和卸載過(guò)程中起著非常重要的作用，從而影響葡萄糖積累與代謝［16］。本研究通過(guò)對(duì)火龍果不同株系和不同部位中HuHXT的表達(dá)量與糖含量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HuHXT基因表達(dá)水平與葡萄糖含量存在負(fù)線性相關(guān)關(guān)系，即葡萄糖含量越低的株系或部位，其HuHXT表達(dá)量相對(duì)較高，尤其97 號(hào)火龍果果實(shí)中HuHXT表達(dá)量是ZH 和128 號(hào)果實(shí)的4 倍多，而葡萄糖含量較低；16 號(hào)火龍果HuHXT相對(duì)表達(dá)量最少，葡萄糖含量卻顯著高于其他株系。可見，HuHXT 在火龍果葡萄糖積累和代謝過(guò)程起著重要作用，推測(cè)火龍果HuHXT 的生理功能是通過(guò)膜蛋白主動(dòng)運(yùn)輸對(duì)葡萄糖進(jìn)行重分配，在成熟果實(shí)中HuHXT表達(dá)量越少，儲(chǔ)藏的葡萄糖越多，果實(shí)品質(zhì)與風(fēng)味就越好。后續(xù)將對(duì)HuHXT基因具體如何參與葡萄糖積累和代謝的相關(guān)機(jī)制作進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)PCR 擴(kuò)增從火龍果中克隆到1 個(gè)HXT基因序列，命名為HuHXT，cDNA 序列長(zhǎng)1 230 bp，編碼410 個(gè)氨基酸。同源性比較表明HuHXT為Sugar-tr 基因家族成員，HuHXT與甜菜、菠菜的HXT4序列同源性最高。HuHXT屬于穩(wěn)定蛋白，有32 個(gè)Ser、15 個(gè)Thr、15 個(gè)Tyr，可能為蛋白激酶的結(jié)合位點(diǎn)，其疏水性較強(qiáng)，存在于生物膜上；二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。成熟期火龍果果實(shí)以積累葡萄糖和果糖為主，且不同株系及同一果實(shí)不同部位中可溶性糖含量及HuHXT 表達(dá)量存在顯著性差異，其中HuHXT表達(dá)量與葡萄糖含量呈負(fù)線性相關(guān)關(guān)系。調(diào)控HuHXT基因表達(dá)水平有望改善火龍果內(nèi)在品質(zhì)形成。