石 晶, 梁新華

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

甘草的主要藥用成分為甘草酸、甘草黃酮、甘草多糖及生物堿類(lèi)物質(zhì)[1],其中甘草酸的含量是評(píng)價(jià)甘草藥材及成藥質(zhì)量的主要依據(jù)[2].甘草酸在植物體內(nèi)的合成起始于甲羥戊酸,然后再經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的酶催化反應(yīng),由鯊烯、氧化鯊烯、β-香樹(shù)脂醇等前體物質(zhì)最終合成.文獻(xiàn)顯示，鯊烯合成酶(squalene synthase,SQS1)與β-香樹(shù)脂醇合成酶(β-amyrin,β-AS)是甘草酸生物合成的關(guān)鍵酶[3],決定著甘草酸在植物體內(nèi)的含量.目前,對(duì)這2種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)、調(diào)控及其功能研究已成為甘草酸生物合成研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn).

研究發(fā)現(xiàn),松科、禾本科、豆科、玄參科等科屬植物具有化感作用,并鑒定出皂苷類(lèi)、酚酸類(lèi)、有機(jī)酸、芳香族化合物等多種化感物質(zhì)[4—9].由這些化感物質(zhì)引起的化感作用既包括不同物種間的抑制或促進(jìn)作用,也包括作用于同物種或者其自身的化感自毒作用.近幾年,有關(guān)根及根狀莖入藥的藥用植物化感作用研究較多[10—11].實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著人工甘草種植年限的延長(zhǎng),出現(xiàn)甘草病蟲(chóng)害逐年加重進(jìn)而影響其藥材質(zhì)量、相似于其他根莖類(lèi)藥材出現(xiàn)的化感自毒現(xiàn)象.這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是否由甘草自身根系分泌物影響所引起,有待進(jìn)一步研究.有機(jī)酸是化感物質(zhì)中的一大類(lèi),研究發(fā)現(xiàn)，甘草根系分泌物中存在低相對(duì)分子質(zhì)量有機(jī)酸——乳酸,其實(shí)際分泌濃度為1×10-4mol/L[12].筆者選擇實(shí)際分泌濃度的乳酸溶液外源培養(yǎng)甘草幼苗,檢測(cè)其對(duì)甘草幼苗根中2種甘草酸生物合成關(guān)鍵酶基因GuSQS1,GubAS的表達(dá)及甘草酸含量的影響,以期為深入研究甘草是否存在化感自毒作用及甘草人工栽培種植提供參考.

1 材料與方法

1.1 甘草種子的萌發(fā)及幼苗的培養(yǎng)

烏拉爾甘草種子,采自寧夏鹽池縣花馬池鎮(zhèn)人工種植甘草基地,由寧夏大學(xué)王俊教授鑒定為甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.).挑選600粒顆粒均一、飽滿、色澤正常的甘草種子,按文獻(xiàn)[3]所述方法處理.隨后在8 個(gè)已高溫、高壓及滅菌的培養(yǎng)皿上鋪上雙層濾紙,將上述600 粒充分吸脹的甘草種子按每皿70 粒,分至8 皿.將所有培養(yǎng)皿置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每天定時(shí)給各組培養(yǎng)皿添加蒸餾水(各2 mL).第3天起,從上述8 個(gè)培養(yǎng)皿中選擇下胚軸突破種皮達(dá)1 cm、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的甘草種子，移至已滅菌的泡沫板上,使每個(gè)泡沫板上甘草種子數(shù)量相同.分別將有種子的泡沫板置于統(tǒng)一大小的塑料紅桶(上沿直徑25 cm、高18 cm),用自來(lái)水培養(yǎng),每桶4 L,每隔1周更換1次自來(lái)水,每天定時(shí)通氣,利用人工光源補(bǔ)充光照,光暗周期為14 h/10 h.

1.2 乳酸外源的處理

為探討甘草根系分泌物乳酸對(duì)甘草酸生物合成關(guān)鍵酶基因及甘草酸含量的影響,排除甘草根系分泌物中其他成分的影響,采用外源乳酸處理的方法.乳酸純品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(w=98 %,HPLC級(jí),CAS號(hào)為50-21-5),按實(shí)際分泌濃度(1×10-4mol/L)配制成相應(yīng)溶液,置于4 ℃冰箱內(nèi)備用.

選取培養(yǎng)2個(gè)月、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的甘草幼苗材料經(jīng)1×10-4mol/L乳酸溶液處理和等量蒸餾水對(duì)照處理.每種處理分別以3盆長(zhǎng)勢(shì)基本一致的甘草幼苗(每盆80株)作為3個(gè)重復(fù),分別于處理0,1,3,6,9,12,24,48,72,96 h取樣.在每一個(gè)取樣時(shí)間,從上述2種處理的6 個(gè)盆中分別每盆選取3 株甘草幼苗,裝于標(biāo)記編號(hào)的布袋中.液氮速凍后,置于-80 ℃超低溫冰箱中備用,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)檢測(cè).

處理96 h結(jié)束,分別從乳酸處理組與對(duì)照組盆中取樣,用吸水紙吸干根部溶液,于105 ℃殺青、70 ℃烘干,粉碎后過(guò)篩,測(cè)定甘草酸的含量.

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GuSQS1,GubAS表達(dá)

所用試劑盒為大連TaKaRa公司出品的MiniBEST Nucleic Acid Isolation Kits,貨號(hào)為9769.具體提取步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,提取后通過(guò)核酸電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量及完整性.首先向無(wú)RNase且冰浴處理的0.5 mL無(wú)菌離心試管中依次加入模板RNA(5.0 μL)、Oligod(T)(3.0 μL).隨后輕輕混勻并離心分離(70 ℃、10 min)后冰浴3 min.再依次向離心管中加入5倍體積RT Buffer(4.0 μL)、dNTP( 1.0 μL)、反轉(zhuǎn)錄酶(0.8 μL)、Rasin(RRI,0.5 μL)、ddH2O( 5.7 μL).輕輕混勻,于42 ℃、60 min、70 ℃,15 min下進(jìn)行離心分離.最后將離心試管置于冰上終止反應(yīng),反轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

在NCBI中查找GuSQS1基因(GenBank登錄號(hào)為AM182329)、GubAS基因(GenBank登錄號(hào)為AB037203.1)及GuActin基因(GenBank登錄號(hào)為EU190972),通過(guò)BioXM 2.6及Primer 5.0設(shè)計(jì)如下特異引物,并由上海生物工程有限公司合成.Actin基因引物(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 為229 bp)序列有GuActin-F:5’-CCTCTCTCTTTATGCCAGTG-3’；GuActin-R:5’-GCTTCTCCTTTATGTCACGG-3’.角鯊烯合成酶基因GuSQS1引物(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為157 bp)序列有GuSQS1-F:5’-GGTCACTAATGCTTTGTTGC -3’;GuSQS1-R:5’-TAACTACAC-

CTCCGAAGACT-3’.β-香樹(shù)脂醇合成酶基因GubAS引物(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為209 bp)序列有GubAS-F:5’-ACAGAGAGAGGATGGTGGAT-3’;GubAS-R:5’-GCCAATCACCCTCTTCCAAT-3’.

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

向反應(yīng)體系中加入SYBR Premix(10.0 μL)、正向引物(0.8 μL)、反向引物(0.8 μL)、模板cDNA(1.0 μL)、ddH2O(7.4 μL).GuSQS1基因反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min.GubAS基因反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min.GuActin基因反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min.

1.6 甘草酸含量的測(cè)定

高效液相色譜檢測(cè)條件按《中國(guó)藥典》(2005版)進(jìn)行.色譜柱為愛(ài)爾蘭Waters Corporation公司生產(chǎn);填料為5 μm ODS2;尺寸為4.6 mm×150 mm;流動(dòng)相為甲醇、醋酸銨(濃度為0.2 mol/L)、冰醋酸(體積比為66∶33∶1);0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后使用;檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm;色譜柱柱溫為室溫;流速為1 mL/min.對(duì)照品溶液的制備:取甘草酸單銨鹽對(duì)照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻后即得(每1 mL中含甘草酸單銨鹽0.2 mg,折合甘草酸0.195 9 mg).供試品溶液的制備:稱(chēng)取前述甘草根粉末0.3 g,置于50 mL容量瓶中,加流動(dòng)相45 mL,超聲處理(功率為200 W,頻率為20 kHz)30 min后取出并放冷,加流動(dòng)相至刻度,搖勻后過(guò)濾即得.

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

所有反應(yīng)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù).將Real-time PCR儀所得的樣品Ct值,利用2-△△Ct方法轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量.通過(guò)Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及圖表的繪制,通過(guò)SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法的特異性

針對(duì)2個(gè)目的基因GuSQS1,GubAS及看家基因GuActin設(shè)計(jì)特異性引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),得到良好的擴(kuò)增曲線和熔解曲線(圖略).由圖可知,擴(kuò)增曲線呈S型,熔解曲線顯示熒光定量PCR產(chǎn)物只有1個(gè)峰,無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增峰.結(jié)果表明，3種引物的特異性較高,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2 甘草根系分泌物乳酸外源處理對(duì)GuSQS1基因表達(dá)的影響

為研究外源乳酸處理對(duì)甘草酸生物合成關(guān)鍵酶基因GuSQS1在其根及葉中的表達(dá),以蒸餾水培養(yǎng)下長(zhǎng)勢(shì)基本一致的甘草幼苗為對(duì)照組、甘草根系分泌物乳酸(1×10-4mol/L)外源處理為處理組.在處理0,1,3,6,9,12,24,48,72,96 h分別采集甘草幼苗的根和葉.以0 h甘草幼苗的根中GuSQS1基因相對(duì)表達(dá)量為1,對(duì)2種處理?xiàng)l件下甘草幼苗根和葉中GuSQS1基因的表達(dá)量進(jìn)行比較.結(jié)果表明,在甘草幼苗的根和葉組中，乳酸(1×10-4mol/L)處理和蒸餾水對(duì)照組、在不同時(shí)間段下，GuSQS1基因的表達(dá)量均存在顯著水平差異.

對(duì)于乳酸處理組,在甘草幼苗的根中，GuSQS1基因的表達(dá)，在整個(gè)處理期內(nèi)呈現(xiàn)小幅升高—降低—快速升高—迅速下降—再升高至與處理初期基本持平的趨勢(shì)(圖1).GuSQS1基因在處理0～3 h時(shí)表達(dá)量顯著下降,在3～6 h表達(dá)量又極顯著升高并于6 h達(dá)到整個(gè)處理期內(nèi)最高值(P<0.01),是對(duì)照組的1.2 倍.在9,12 h時(shí)表達(dá)量極顯著下降,在24 h時(shí)該基因表達(dá)量又顯著上升,在24～96 h該基因表達(dá)量變化相對(duì)平穩(wěn),與處理0 h的表達(dá)量相近.而對(duì)于蒸餾水對(duì)照組,在甘草幼苗的根中，GuSQS1基因的表達(dá)，則呈現(xiàn)升高—降低—升高—降低的變化趨勢(shì),其中GuSQS1基因的表達(dá)量在9 h極顯著高于其他時(shí)間,表達(dá)量次高峰出現(xiàn)在3,6,72 h,這3個(gè)時(shí)間下的表達(dá)量又極顯著高于其他時(shí)間下的.整體而言,在乳酸處理組的甘草幼苗根中，GuSQS1基因的表達(dá)量顯著低于蒸餾水對(duì)照組的(P<0.05)(圖1).

在甘草幼苗的葉中,GuSQS1基因的表達(dá)量極顯著低于其根中的(P<0.01),且為根中GuSQS1基因表達(dá)量的10%～50%.其中，在乳酸處理組的甘草幼苗葉中，GuSQS1基因的表達(dá)量在整個(gè)處理期內(nèi)均低于1,在不同時(shí)間，葉中該基因表達(dá)量的變化基本呈現(xiàn)降低—升高—降低的變化趨勢(shì)：從0 h開(kāi)始下降,1～6 h逐漸升高,并在6 h達(dá)到最高值,極顯著高于其他時(shí)間下的表達(dá)量(P<0.01).但從6 h后GuSQS1基因的表達(dá)量持續(xù)下降,其中在24 h降至整個(gè)處理期內(nèi)最低,之后GuSQS1基因的表達(dá)雖有小幅上升,但依然極顯著低于處理6 h時(shí)的(P<0.01).在蒸餾水對(duì)照組的葉中，GuSQS1基因的表達(dá)在整個(gè)處理期內(nèi)的高峰出現(xiàn)在9～12 h,最低值出現(xiàn)在1 h.比較乳酸處理與蒸餾水對(duì)照組葉中GuSQS1基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)乳酸處理的葉中GuSQS1基因表達(dá)量高峰的出現(xiàn)較蒸餾水對(duì)照組提早3 h.在乳酸溶液處理?xiàng)l件下、整個(gè)處理期內(nèi)，該基因在葉中的表達(dá)量略高于蒸餾水對(duì)照組的(圖1).

圖1 甘草根系分泌物乳酸對(duì)甘草幼苗根和葉中GuSQS1基因表達(dá)的影響

2.3 甘草根系分泌物乳酸外源處理對(duì)GubAS基因表達(dá)的影響

以蒸餾水培養(yǎng)下的甘草幼苗為對(duì)照組,以甘草根系分泌物乳酸(1×10-4mol/L)外源處理甘草幼苗.在處理0～96 h分別采集甘草幼苗,以0 h根中GubAS基因相對(duì)表達(dá)量為1,對(duì)幼苗根和葉中不同時(shí)間下GubAS基因的表達(dá)進(jìn)行分析.結(jié)果表明,在甘草幼苗的根和葉中，乳酸(1×10-4mol/L)處理和蒸餾水對(duì)照組在不同時(shí)間下，GubAS基因的表達(dá)量均存在顯著及極顯著水平差異.

在甘草幼苗的根中，GubAS基因的表達(dá)量極顯著高于葉中的(P<0.01).且與乳酸(1×10-4mol/L)處理后GuSQS1基因在根中的表達(dá)變化趨勢(shì)基本相似.乳酸處理后,甘草幼苗根中GubAS基因的表達(dá)也呈現(xiàn)降低—升高—降低—升高—降低的變化趨勢(shì)(圖2):從0～3 h逐漸降低,3～6 h迅速升高,并在6 h達(dá)到第1個(gè)峰值,且是0 h表達(dá)量的1.94 倍.從6～12 h表達(dá)量迅速下降,9～12 h時(shí)表達(dá)量恢復(fù)到與3 h相似的程度,隨后從12～48 h再次逐漸升高,并在48 h達(dá)到表達(dá)量的第2個(gè)峰值,且6,48 h的表達(dá)量均極顯著高于其他時(shí)間下的(P<0.01),從48～96 h表達(dá)量又一次逐漸下降.與乳酸處理組表現(xiàn)不同,GubAS基因在對(duì)照組的根中，呈現(xiàn)升高—降低—升高—降低的表達(dá)趨勢(shì),表達(dá)量從0～3 h逐漸升高,在3 h后下降,但在9 h達(dá)到第1個(gè)表達(dá)峰值,且是0 h表達(dá)量的2.18 倍.隨后表達(dá)量迅速下降,在12 h恢復(fù)到處理0 h的表達(dá)水平,之后表達(dá)量再一次升高,并于24 h達(dá)到表達(dá)的第2個(gè)峰值,且是0 h表達(dá)量的2.10 倍.3,9,24 h的表達(dá)量均極顯著高于其他處理時(shí)間下的(P<0.01).從24～96 h表達(dá)量又一次下降,在96 h表達(dá)量處于整個(gè)處理期最低值,極顯著低于其他時(shí)間下的(P<0.01)(圖2).

圖2 甘草根系分泌物乳酸對(duì)甘草幼苗根和葉中GubAS基因表達(dá)的影響

與GuSQS1基因在根和葉中的表達(dá)情況相同,葉中GubAS基因的表達(dá)量極顯著低于根中的(P<0.01).在乳酸處理組甘草幼苗的葉中，GubAS基因的表達(dá)量在整個(gè)處理期內(nèi)均低于1,在不同時(shí)間下，該基因表達(dá)量的變化也基本呈現(xiàn)降低—升高—降低的變化趨勢(shì),其中，6 h表達(dá)量雖然是整個(gè)處理期內(nèi)最大,但與0 h時(shí)葉中的不存在顯著水平差異.在乳酸處理?xiàng)l件下,0,6 h甘草幼苗葉中GubAS基因的表達(dá)量極顯著高于其他時(shí)間下的(P<0.01).在蒸餾水對(duì)照組的葉中，各個(gè)處理時(shí)間內(nèi)的GubAS基因在表達(dá)量變化上較乳酸處理的平穩(wěn),表達(dá)量也較乳酸處理下葉中的更低.其中，72,96 h的表達(dá)量值顯著低于其他時(shí)間下的(P<0.05)(圖2).

2.4 甘草根系分泌物乳酸外源處理對(duì)甘草幼苗根中甘草酸含量的影響

處理96 h時(shí),乳酸處理組甘草幼苗根中的甘草酸含量顯著低于對(duì)照處理組的(圖3),且是對(duì)照組的82%.說(shuō)明一定時(shí)間乳酸外源處理,可抑制甘草幼苗根中合成較多的甘草酸.

3 討論

化感物質(zhì)是植物生命活動(dòng)中產(chǎn)生的一些次生代謝物質(zhì),大多數(shù)為小分子的酚、酸.許多植物中存在化感自毒作用,如花生[13]、大豆[14]、棉花[15]、大蒜[16]等作物，根莖類(lèi)藥用植物如人參[17]、丹參[18]、地黃[19]、當(dāng)歸[20]、貝母[21]和三七[22]等.

圖3 甘草根系分泌物乳酸外源處理對(duì)甘草幼苗根中甘草酸含量的影響

乳酸是一種低相對(duì)分子質(zhì)量有機(jī)酸.研究表明，根系分泌的有機(jī)酸，在植物養(yǎng)分活化與吸收過(guò)程中有重要的作用.近年來(lái)，關(guān)于低相對(duì)分子質(zhì)量有機(jī)酸化感作用的研究較多,但大多是有機(jī)酸對(duì)植物生長(zhǎng)、生理指標(biāo)、土壤環(huán)境等所產(chǎn)生的影響以及對(duì)礦物中某些元素釋放的促進(jìn)等[23—24].該研究在甘草種子化感自毒作用的研究基礎(chǔ)上,分析實(shí)際分泌濃度乳酸外源施用，對(duì)甘草酸生物合成中2種關(guān)鍵酶基因(GuSQS1,GubAS)在甘草根及葉中的表達(dá)及甘草根中甘草酸含量的影響.結(jié)果表明,經(jīng)乳酸(1×10-4mol/L)處理后，甘草幼苗根中GuSQS1,GubAS基因的表達(dá)量都極顯著高于葉中的(P<0.01).在處理6 h時(shí),甘草幼苗根和葉中GuSQS1,GubAS基因的表達(dá)量均達(dá)到最高峰.且在乳酸處理下,葉中2個(gè)基因表達(dá)量雖然較根中的低,但極顯著高于對(duì)照組葉中的(P<0.01).因此，甘草中是否存在葉中合成的少量角鯊烯以及β-香樹(shù)酯醇向根部運(yùn)輸,再與根部合成的上述2種物質(zhì)進(jìn)一步生物合成甘草酸,這有待于進(jìn)一步深入研究.從整個(gè)處理周期看,外源乳酸處理下GuSQS1,GubAS基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組中的.在處理周期末,甘草酸的含量也是乳酸處理組顯著低于對(duì)照組.實(shí)際分泌濃度的乳酸整體上降低了GuSQS1,GubAS基因的表達(dá),導(dǎo)致處理期末甘草幼苗根中甘草酸的含量下降.說(shuō)明甘草酸生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)改變,可提高或降低該合成途徑中次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率.針對(duì)該研究結(jié)果,如果從提高甘草酸含量的角度看,可采用乳酸短期的外源處理方法.

研究結(jié)果初步說(shuō)明，甘草根系實(shí)際分泌濃度的乳酸外源處理甘草幼苗,雖然在短期內(nèi)提高了2個(gè)甘草酸生物合成中關(guān)鍵酶基因的表達(dá),但從整個(gè)處理周期看,降低了2個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá),從而降低了中間代謝物質(zhì)(角鯊烯和β-香樹(shù)脂醇)的合成及積累,最終影響了甘草酸的生物合成與積累.從化感作用角度看,在實(shí)際分泌濃度處理6 h內(nèi),表現(xiàn)出明顯的化感促進(jìn)作用,但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),反而抑制了GuSQS1,GubAS基因的表達(dá),降低了甘草酸的含量,表現(xiàn)出化感自毒作用.在實(shí)際的生長(zhǎng)條件下,甘草根系分泌物是諸多物質(zhì)共存的混合物.研究每一種根系分泌物在實(shí)際分泌濃度下，對(duì)甘草酸生物合成的影響,可為深入探討甘草根系中實(shí)際根系分泌物對(duì)甘草藥材品質(zhì)的影響提供參考.

4 結(jié)論

以實(shí)際分泌濃度(1×10-4mol/L)乳酸外源處理甘草幼苗不同時(shí)間,GuSQS1,GubAS基因的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的改變.GuSQS1基因在乳酸外源處理甘草幼苗的根和葉中，6 h時(shí)達(dá)到表達(dá)量的最大值,而對(duì)照組在9 h時(shí)達(dá)到表達(dá)量最大值.GubAS基因在乳酸外源處理甘草幼苗根6,48 h時(shí)達(dá)到表達(dá)量的2個(gè)高峰,而對(duì)照組在9,24 h時(shí)達(dá)到表達(dá)量的2個(gè)高峰.在處理末期,處理組甘草幼苗根中的甘草酸含量顯著低于對(duì)照組中的.研究表明,實(shí)際分泌濃度的乳酸在3 d的處理時(shí)間下,對(duì)甘草自身產(chǎn)生了一定化感自毒作用.