王 澤, 賈晟楠, 華智超, 牛邦彥, 徐綺思, 任東軍, 高 淼

(1. 沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 110034;2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室, 北京 100081)

0 引 言

細菌是土壤微生物中數(shù)量最多的一個類群,占土壤微生物總量的70%～90%,它們在土壤有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)化中起著重要作用[1]。土壤是微生物的主要物質(zhì)基礎(chǔ),1 g土壤中有高達10余萬種、數(shù)以億萬計的微生物。土壤微生物是驅(qū)動物質(zhì)循環(huán)過程的引擎,也是地球上進行物質(zhì)循環(huán)與能量流動的重要樞紐,對人體健康、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、土壤環(huán)境修復(fù)等均起著重要作用[2-3]。

純培養(yǎng)技術(shù)一直是微生物學(xué)研究的基石,但是單一的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和生境與自然環(huán)境中微生物多樣性、協(xié)同代謝等明顯矛盾,從而成為部分微生物難以復(fù)蘇的主要障礙。細菌共同協(xié)作的自然生存方式的崩潰、生境的極度營養(yǎng)變化和生態(tài)位巨變等是微生物可培養(yǎng)性低的主要生態(tài)學(xué)原因[4]。對此問題,國內(nèi)外開展了較多在改進微生物培養(yǎng)方法、開發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)方面的研究工作,分離獲得了一批新的微生物菌株。如通過改變培養(yǎng)基的配方、降低培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、添加某些微生物生長因子可顯著提高平板培養(yǎng)的土壤微生物種類和數(shù)量[5];采用多種培養(yǎng)基組合亦可提高土壤微生物的可培養(yǎng)性。孫創(chuàng)等[6]通過利用改良的2216E等5種培養(yǎng)基進行微生物培養(yǎng),獲得了大量可培養(yǎng)細菌,具有較高的多樣性。武鳳霞等[7]以常規(guī)微生物分離培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度為基礎(chǔ),對貧營養(yǎng)、富營養(yǎng)培養(yǎng)基在低溫條件下(8℃)獲得的培養(yǎng)物進行比較分析,了解培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度對低溫土壤微生物分離培養(yǎng)的影響,結(jié)果表明,在低溫培養(yǎng)條件下,稀釋培養(yǎng)基營養(yǎng)成分可以提高耐低溫可培養(yǎng)性微生物種類,但會降低耐低溫可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。

本文選擇LB,Flour Medium,YEM Medium和TWYE Medium這4種不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基,對大田土壤和溫室大棚土壤中可培養(yǎng)細菌的數(shù)量和多樣性進行比較分析,深入了解不同培養(yǎng)基對不同微生物的培養(yǎng)能力,為分離土壤細菌培養(yǎng)基的設(shè)計及選用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品

2020年12月于北京中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室(39°N,116°E)中取番茄若干,將番茄根部土壤輕輕抖落得到溫室土樣,于沈陽市于洪區(qū)后辛臺村(41°N,123°E)中獲取番茄大田番茄土樣。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基: 10 g Tryptone,5 g Yest extract,10 g NaCl,18 g Agar,蒸餾水定容至1 L。

Flour Medium培養(yǎng)基、YEM Medium培養(yǎng)基、TWYE Medium培養(yǎng)基詳見文獻[8]。

1.1.3 主要試劑

Plain flour, Mannitol, NaCl, Agar(Solarbio公司); TRYPTONE, Yeast extract(OXOID公司); K2HPO4(西隴科技股份有限公司); MgSO4·7H2O(北京化學(xué)試劑公司); CaCO3(國藥集團化學(xué)試劑有限公司); 蔗糖(光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 土壤懸液制備

取備用土樣1 g于預(yù)先裝好無菌玻璃珠和10 mL無菌水的搖菌管中,靜置10 min,室溫下在150 rpm·min-1的搖床震蕩10 min,制成土壤母液菌懸液,然后取1 mL土壤菌懸液用無菌水進行梯度稀釋,獲得10-1～10-7稀釋濃度的土壤菌懸液。

1.2.2 平板培養(yǎng)

每個樣品涂布5個稀釋度,每個稀釋度3個重復(fù)。番茄土壤懸液稀釋涂布濃度:LB培養(yǎng)基10-7～10-3,其余培養(yǎng)基10-6～10-2。吸取100 μL菌懸液于平板中,加入無菌玻璃珠,4個方向平行搖動從而均勻涂布,將涂布完成的平板于28 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。3 d后開始進行計數(shù)。計數(shù)后進行分純,純化3次使菌株完全純化。

1.3 測序方法

1.3.1 菌株DNA提取

將1.5 mL無菌離心管中加入100 μL無菌水,選擇平板上肉眼可見的單菌落置于1.5 mL無菌離心管中,使其充分溶于水,100 ℃金屬浴中裂解15 min后于-20 ℃冰箱放置30 min,室溫放置解凍,12 000 rpm·min-1離心1 min,獲得的上清液即為提取到的DNA。

1.3.2 PCR擴增

使用細菌通用引物27F/1492R進行16S rDNA基因擴增。以提取出的DNA為模板,利用16S rDNA基因的引物對27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)來進行擴增。PCR采用25 μL反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸90 s;30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取1 μL PCR擴增產(chǎn)物與DNA Marker,用2%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測,條件為恒定電壓120 V,電流330 mA,電泳30 min。隨后觀察電泳熒光條帶以辨別DNA是否提取成功,驗證后,將提取成功的DNA樣品送往北京擎科生物科技有限公司進行DNA測序。

1.3.4 種屬鑒定

將測得的DNA序列在Ezbiocloud(www.ezbiocloud.net/eztaxon)進行比對,以序列相似度大于或等于98.7%確定其中的分類學(xué)依據(jù)[9]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

本研究采用SPSS 19.0 版本軟件(Chicago,IL,USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析,統(tǒng)計檢驗為卡方檢驗(X2),以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn);采用Venn diagram分析來表示菌種之間的重疊情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基分離土壤微生物的數(shù)量分析

番茄大田和溫室大棚土壤菌懸液在4種培養(yǎng)基平板計數(shù)的結(jié)果見表1。從表中可以看出,2種土壤樣品分別在LB,Flour Medium,YEM Medium和TWYE Medium,每種培養(yǎng)基上生長的細菌數(shù)量相近,均未達到顯著性差異(P<0.05)。但是,4種培養(yǎng)基間細菌數(shù)量差異較大,LB培養(yǎng)基上生長的細菌數(shù)量最多,與其他培養(yǎng)基具有顯著性差異(P<0.05);其次是YEM Medium培養(yǎng)基和TWYE Medium培養(yǎng)基,互相比較沒有顯著性差異(P>0.05);Flour Medium培養(yǎng)基上生長的細菌數(shù)量最少,與YEM Medium和LB培養(yǎng)基具有顯著性差異(P<0.05)。2種土樣在LB培養(yǎng)基上生長的細菌平均數(shù)量為2.18×106cfu(colony forming unit)·g-1土, 是YEM Medium、TWYE Medium和Flour Medium培養(yǎng)基細菌平均數(shù)量的2.04倍、1.88倍和3.5倍。

表1 平板培養(yǎng)基分離土壤微生物計數(shù)(×104cfu/g土)Table 1 Microbial count of soil separated by plate medium

2.2 不同培養(yǎng)基上微生物的分離鑒定

圖1 4種培養(yǎng)基分離細菌土壤細菌數(shù)量Fig.1 Bacteria isolated from soil by four kinds of culture media

2種土壤樣品經(jīng)梯度稀釋后分別在不同培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)72 h,經(jīng)分離純化共獲得細菌 71株,其中分離自Flour Medium培養(yǎng)基18株,LB培養(yǎng)基18株,TWYE Medium培養(yǎng)基21株,YEM Medium培養(yǎng)基14株(圖1)。經(jīng)16S rDNA基因測序,結(jié)果在Ezbiocloud比對(表2)。結(jié)果顯示,分離的71株細菌分別屬于18個屬36個種,其中Streptomyces屬28株,Bacillus屬12株,Microbacterium屬6株,Leifsonia和Brucella屬各4株,Flavobacterium屬3株,Paenibacillus和Rhodanobacter屬各2株,Pectobacterium,Cytobacillus,Promicromonospora,Arthrobacter,Nocardia,Mycolicibacterium,Pradoshia,Cellulosimicrobium,Massilia,Neobacillus屬各1株。

表2 分離到的71株細菌的分類信息表Table 2 Taxonomic information of 71 strains of bacteria

溫室土較大田土分離的菌種種類多。4種培養(yǎng)基中,LB分離到的菌種種類最多。在所有屬中,分離的Streptomyces最多,且主要在TWYE Medium培養(yǎng)基上分離到,另外,Pectobacterium,Promicromonospora和Cytobacillus僅從Flour Medium培養(yǎng)基中分離。

2.3 不同培養(yǎng)基分離土壤微生物分布情況

圖2 4種培養(yǎng)基分離細菌分布情況Fig.2 Distribution of bacteria isolated from four media

利用Venn diagram來分析菌種之間的重疊情況。從圖2可以看出,TWYE Medium培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基不重疊部分即僅由各自培養(yǎng)基分離的菌株種類大于Flour Medium培養(yǎng)基和YEM Medium培養(yǎng)基,Flour Medium培養(yǎng)基與YEM Medium培養(yǎng)基分離的相同菌株種類較多,TWYE Medium培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基分離的相同菌株種類較多,YEM Medium培養(yǎng)基與Flour Medium培養(yǎng)基分離的相同菌株種類較多,LB培養(yǎng)基與Flour Medium培養(yǎng)基和TWYE Medium培養(yǎng)基分離的相同菌株種類較多,且有2種菌株種類在4種培養(yǎng)基上均能分離到(表3)。其中Pectobacterium屬、Cytobacillus屬和Promicromonospora屬主要由Flour Medium培養(yǎng)基分離得到;Flavobacterium屬和Cellulosimicrobium屬主要由TWYE Medium培養(yǎng)基分離得到;Massilia屬和Neobacillus屬主要由YEM Medium培養(yǎng)基得到;Arthrobacter屬、Rhodanobacter屬、Nocardia屬、Mycolicibacterium屬、Pradoshia屬主要由LB培養(yǎng)基培養(yǎng)得到。

表3 番茄 71株細菌的分布情況表Table 3 Distribution of 71 strains of bacteria

2.4 潛在新種

根據(jù)16S rDNA基因結(jié)果顯示,本文所得的71株細菌中2株菌與其最高相似菌株16S rRNA基因相似度低于98.7%,為潛在新種,占總分菌2.82%,分別為黃桿菌屬(Flavobacterium)1株[10],普拉多什菌屬(Pradoshia)1株[11]。

從土壤樣品來看,此2株潛在新菌均是來自溫室土;從培養(yǎng)基分離來看,2株潛在新種中,1株與Pradoshia屬最高同源性分離自LB培養(yǎng)基,1株與Flavobacterium屬最高同源性分離自TWYE Medium培養(yǎng)基。其余培養(yǎng)基沒有篩到潛在新種。

3 討 論

目前對于不同培養(yǎng)基分離土壤微生物的報道較多,不同培養(yǎng)基由于組成成分不同,對細菌分離的選擇性具有一定差異,可根據(jù)不同的研究材料進行培養(yǎng)基的改良及條件的改進[12-14]。本研究通過4種培養(yǎng)基對2種土壤樣品,2種培養(yǎng)基進行細菌的分離純化和培養(yǎng),獲得了較豐富的微生物菌種資源。培養(yǎng)基分別為LB培養(yǎng)基[15]、Flour Medium培養(yǎng)基、YEM Medium培養(yǎng)基和TWYE Medium培養(yǎng)基。利用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌微生物,可提高土壤細菌的可培養(yǎng)性。

本研究得到了4種培養(yǎng)基分離土壤細菌,類群的多樣性分析的初步結(jié)果經(jīng)過16S rDNA基因序列相似性比對,共分離得71株細菌,分別屬于18個屬36個種。不同的培養(yǎng)基分離獲得的細菌群落組成差異較大。Flour Medium培養(yǎng)基上分離得到Leifsonia屬、Pectobacterium屬、Streptomyces屬等;YEM Medium培養(yǎng)基上分離得到Streptomyces屬、Bacillus屬、Microbacterium屬等;YEM Medium培養(yǎng)基分離得到Streptomyces屬、Bacillus屬、Brucella屬等;LB培養(yǎng)基分離得到Leifsonia屬、Streptomyces屬、Bacillus屬等。且其中分離到2株潛在新種,一株分離自LB培養(yǎng)基,與Pradoshiaeiseniae的16S rDNA基因序列相似性為98.47%;一株分離自TWYE Medium培養(yǎng)基,與Flavobacteriumzhairuonense的16S rDNA基因序列相似性為97.72%。潛在新種還有待進一步研究。