王旭紅，閆曙光，惠 毅，史 捷，李京濤

基于肺泡巨噬細(xì)胞M2極化的麻黃-大黃藥對(duì)治療急性肺損傷的作用機(jī)制研究

王旭紅1，閆曙光2，惠 毅2，史 捷1*，李京濤3*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，陜西 咸陽(yáng) 712000 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院感染科，陜西 咸陽(yáng) 712000

探討麻黃-大黃藥對(duì)對(duì)急性肺損傷（acute lung injury，ALI）大鼠肺泡替代激活的巨噬細(xì)胞（alternatively activated macrophages，M2）極化的調(diào)控作用及其機(jī)制。Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及麻黃-大黃低、中、高劑量（2.2、4.4、8.8 g/kg）組和地塞米松（5 mg/kg）組，大鼠ip脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制備ALI模型，造模后立即給予藥物進(jìn)行干預(yù)，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀(guān)察肺組織病理變化；采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80和M2標(biāo)記物CD206，以及F4/80和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的共表達(dá)；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織F4/80和CD206陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化；采用qRT-PCR法檢測(cè)肺組織中精氨酸酶-1（arginase-1，）和mRNA表達(dá)；采用Western blotting法檢測(cè)肺組織中Arg-1和IL-10蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)水腫增厚，炎性細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，其中巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增多；免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量增多、表達(dá)增強(qiáng)，M2巨噬細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)、數(shù)量增多；M2肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子和mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，麻黃-大黃高、中劑量組肺組織病理狀態(tài)明顯改善，肺組織M2肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步升高，抗炎因子IL-10和促修復(fù)因子Arg-1蛋白和mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（＜0.01）。麻黃-大黃藥對(duì)可促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞M2極化，增加抗炎因子激活和釋放，抑制炎癥反應(yīng)，從而治療急性肺損傷。

麻黃-大黃藥對(duì)；急性肺損傷；肺泡巨噬細(xì)胞；M2極化；炎癥反應(yīng)

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由病毒、細(xì)菌、感染等因素誘發(fā)的肺組織免疫炎癥性疾病，由于免疫細(xì)胞的過(guò)度活化，炎癥反應(yīng)失控，形成炎癥因子風(fēng)暴，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，造成肺組織通/換氣功能障礙[1]。在眾多的免疫細(xì)胞中，肺組織巨噬細(xì)胞參與了炎癥的發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程。肺組織巨噬細(xì)胞長(zhǎng)期存在于肺中，是肺局部炎癥微環(huán)境和炎癥反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，主要包括肺泡巨噬細(xì)胞、肺間充質(zhì)巨噬細(xì)胞、支氣管巨噬細(xì)胞等，其中肺泡巨噬細(xì)胞所占比例大于90%，是肺內(nèi)巨噬細(xì)胞發(fā)揮生物活性的主體[2]。研究表明，肺泡巨噬細(xì)胞極化失衡是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇和ALI發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，巨噬細(xì)胞根據(jù)環(huán)境刺激反應(yīng)的不同，可被激活為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞（classically activated macrophages，M1）和替代激活的巨噬細(xì)胞（alternatively activated macrophages，M2），被稱(chēng)為巨噬細(xì)胞的M1/M2型極化[3]。M1型巨噬細(xì)胞以吞噬殺菌、釋放炎癥因子、促炎作用為主，M2型巨噬細(xì)胞以釋放抗炎因子、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)功能為主。在炎癥反應(yīng)過(guò)重時(shí)促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞M2型極化能有效地抑制炎癥反應(yīng)，阻止ALI的發(fā)展[4]。

肺腸合治是中醫(yī)藥治療ALI的臨床常用治法，麻黃-大黃是體現(xiàn)肺腸合治法的主要藥對(duì)，多個(gè)以麻黃-大黃為核心藥物的方藥被臨床和實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)ALI療效確切[5-7]。已有研究表明麻黃、大黃能抑制巨噬細(xì)胞M1極化，在哮喘和膿毒血癥的治療中發(fā)揮抗炎作用[8-10]。目前麻黃-大黃藥對(duì)是否能夠通過(guò)促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞M2極化抑制炎癥反應(yīng)，從而防治ALI尚不清楚。因此，本研究采用ip脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制備ALI大鼠模型，考察麻黃-大黃藥對(duì)抑制炎癥反應(yīng)、干預(yù)肺泡巨噬細(xì)胞M2極化的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，8周齡，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（川）2020-030。動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2020DW-011-09）。

1.2 藥品與試劑

大黃免煎顆粒（批號(hào)20120030）、麻黃免煎顆粒（批號(hào)20020037）購(gòu)自四川新綠色科技發(fā)展有限公司；地塞米松注射液（批號(hào)20200902，5 mg/mL）購(gòu)自重慶市先鋒動(dòng)物藥業(yè)有限公司；LPS（批號(hào)065M8209V）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；β-actin抗體（批號(hào)AF1627）、F4/80抗體（批號(hào)30325T）購(gòu)自美國(guó)CTS公司；CD206抗體（批號(hào)sc-376012）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）抗體（批號(hào)sc-365858）購(gòu)自Santa crus公司；精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）抗體（批號(hào)DF6657）購(gòu)自Affinity公司；熒光FITC標(biāo)記的IgG抗體（批號(hào)BA1101）、熒光Cy3標(biāo)記的IgG抗體（批號(hào)BA1032）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；APC標(biāo)記F4/80抗體（批號(hào)123116）、PE標(biāo)記CD206抗體（批號(hào)141705）購(gòu)自Biolegend公司。

1.3 儀器

全自動(dòng)高壓滅菌器（日本三洋公司）；RM 2016型病理切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；JK-6型組織攤烤片機(jī)、JT-12J型脫水機(jī)（武漢俊杰公司）；HI650型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；C2500-R-230V型微型高速離心機(jī)（美國(guó)Labnet公司）；DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠(chǎng)）；ECLIPSE Ts2型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；cytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；EDC-810型qRT-PCR系統(tǒng)（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備

麻黃9 g、大黃12 g為成人每次給藥劑量，成人按60 kg體質(zhì)量計(jì)算，動(dòng)物給藥劑量根據(jù)成人與大鼠體質(zhì)量換算，確定大鼠的等效劑量為2.2 g/kg，本研究中麻黃-大黃藥對(duì)的低、中、高劑量組對(duì)應(yīng)的劑量分別為2.2、4.4、8.8 g/kg。麻黃-大黃免煎顆粒溶于蒸餾水中，分別配制成質(zhì)量濃度為1.1、2.2、4.4 g/mL的混懸液。

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

60只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、麻黃-大黃低、中、高劑量（2.2、4.4、8.8 g/kg）組和地塞米松（5 mg/kg）組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠ip LPS（10 mg/kg）制備ALI模型[11]，造模后各給藥組立即ig 2 mL相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積生理鹽水，每8小時(shí)1次，連續(xù)3次。末次給藥8 h后，大鼠ip 25%戊巴比妥麻醉處死，取肺組織備用。

2.3 麻黃-大黃對(duì)ALI大鼠肺組織病理的影響

取各組大鼠肺組織，固定于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，石蠟切片（3～4 μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水；進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

2.4 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)肺組織肺泡巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80和M2肺泡巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206、IL-10的表達(dá)

取各組大鼠肺組織石蠟切片，脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，加入枸櫞酸緩沖液加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；加入一抗F4/80（1∶100），于4 ℃濕盒中避光孵育15 h；加入熒光二抗染色（紅色），加入血清封閉后，加入一抗CD206（1∶100）、IL-10（1∶50），于4 ℃濕盒中避光孵育15 h，加入熒光二抗染色（綠色），復(fù)染核，封片，于顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞和CD206標(biāo)記的M2肺泡巨噬細(xì)胞百分比

取各組大鼠肺組織，剪碎后加入0.5%膠原酶和0.25%胰酶，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2～3 h，將肺組織懸液濾過(guò)、離心、清洗、重懸得到細(xì)胞，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，分別加入F4/80（0.125 mg/test）和CD206（0.125 mg/test），4 ℃避光孵育30 min，1500 r/min離心5 min，避光孵育50 min；加入工作液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)肺組織IL-10和Arg-1 mRNA表達(dá)

取各組大鼠肺組織100 mg，加入組織裂解液制成勻漿，Trizol法提取總RNA，并測(cè)定純度和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系為20 μL，PCR擴(kuò)增程序：90 ℃循環(huán)預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火延伸34 s，共設(shè)定40個(gè)循環(huán)。相對(duì)定量法計(jì)算各指標(biāo)mRNA的2???Ct值。引物序列由北京擎科生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’)產(chǎn)物大小/bp GAPDHF: ATGGGTGTGAACCACGAGA229 R: CAGGGATGATGTTCTGGGCA IL-10F: GCTGGACAACATACTGCTAACCG218 R: CACAGGGGAGAAATCGATGACAG Arg-1F: ATCGTGTACATTGGCTTGCG184 R: CGTCGACATCAAAGCTCAGG

2.7 Western blotting檢測(cè)肺組織IL-10和Arg-1蛋白表達(dá)

取各組大鼠肺組織，加入裂解液勻漿，裂解30 min。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入IL-10（1∶1000）、Arg-1（1∶1000）、β-actin（1∶500）特異性抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000），37 ℃搖床孵育2 h，顯影并掃描膠片。采用Image-J凝膠分析軟件定量條帶強(qiáng)度，以?-actin作為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA）。

3 結(jié)果

3.1 麻黃-大黃對(duì)ALI大鼠肺組織病理的影響

如圖1所示，對(duì)照組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，呈空腔狀，肺泡排列整齊，周?chē)g隙內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺泡塌陷，結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)增厚、水腫，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道狹窄并可見(jiàn)大量紅細(xì)胞；麻黃-大黃高、中劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，肺間質(zhì)增厚與水腫減輕，氣道出血與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；麻黃-大黃低劑量組大鼠肺組織仍然可以見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與氣道出血，肺間質(zhì)水腫改變不明顯，但可見(jiàn)個(gè)別肺泡結(jié)構(gòu)恢復(fù)；地塞米松組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，但仍可見(jiàn)肺間質(zhì)水腫。

3.2 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)肺組織肺泡巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80和M2肺泡巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206的表達(dá)

如圖2所示，對(duì)照組大鼠肺組織偶見(jiàn)F4/80陽(yáng)性（紅色）和CD206陽(yáng)性（綠色）肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)；模型組大鼠肺組織F4/80陽(yáng)性和CD206陽(yáng)性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，熒光表達(dá)增強(qiáng)，且部分CD206陽(yáng)性細(xì)胞與F4/80陽(yáng)性細(xì)胞共定位表達(dá)，表明在急性肺損傷發(fā)生時(shí)，LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞大量活化，同時(shí)部分肺泡巨噬細(xì)胞向M2型極化，呈現(xiàn)抗炎表型；麻黃-大黃各劑量組和地塞米松組大鼠肺組織F4/80陽(yáng)性肺泡巨噬細(xì)胞顯著減少，熒光強(qiáng)度減弱，CD206陽(yáng)性巨噬細(xì)胞則明顯增多，說(shuō)明麻黃-大黃能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞的活化，同時(shí)促進(jìn)其向M2極化。

3.3 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80和抗炎因子IL-10的表達(dá)

如圖3所示，對(duì)照組大鼠肺組織可見(jiàn)F4/80陽(yáng)性肺泡巨噬細(xì)胞（紅色）和IL-10（綠色）少量表達(dá)；模型組大鼠肺組織F4/80陽(yáng)性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，熒光表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)IL-10熒光表達(dá)也明顯增強(qiáng)，且部分IL-10和F4/80呈共表達(dá)，IL-10是由M2型巨噬細(xì)胞釋放的抗炎因子，兩者的共表達(dá)表明在A(yíng)LI發(fā)生時(shí)，部分肺泡巨噬細(xì)胞會(huì)向M2型極化，同時(shí)釋放抗炎因子以抑制炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷；麻黃-大黃高、中劑量和地塞米松組大鼠肺組織F4/80陽(yáng)性肺泡巨噬細(xì)胞減少，IL-10表達(dá)進(jìn)一步升高；麻黃-大黃低劑量組可見(jiàn)大量F4/80陽(yáng)性肺泡巨噬細(xì)胞和少量的IL-10的共表達(dá)，說(shuō)明麻黃-大黃高、中劑量藥物能促進(jìn)M2肺泡巨噬細(xì)胞激活并釋放抗炎因子IL-10，從而抑制炎癥反應(yīng)，緩解ALI。

圖1 麻黃-大黃對(duì)ALI大鼠肺組織病理的影響(HE, ×400)

圖2 各組大鼠肺組織巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80和M2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD206的表達(dá) (×100)

圖3 各組大鼠肺組織巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/800和炎癥因子IL-10的表達(dá)變化(×100)

3.4 流式細(xì)胞檢測(cè)肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞和CD206標(biāo)記的M2肺泡巨噬細(xì)胞百分比

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞百分比和CD206標(biāo)記的M2肺泡巨噬細(xì)胞百分比均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞百分比均顯著降低（＜0.01），CD206標(biāo)記的M2肺泡巨噬細(xì)胞百分比均顯著升高（＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)麻黃-大黃能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞的激活，促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞M2極化。

3.5 qRT-PCR檢測(cè)肺組織IL-10和Arg-1 mRNA表達(dá)

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織抗炎因子和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，麻黃-大黃高、中劑量組大鼠肺組織和mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高（＜0.01）。

3.6 Western blotting檢測(cè)肺組織IL-10和Arg-1蛋白表達(dá)

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織抗炎因子IL-10和Arg-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，麻黃-大黃高、中劑量組大鼠肺組織IL-10和Arg-1蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高（＜0.01）。表明麻黃-大黃能夠促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞釋放抗炎因子。

4 討論

目前針對(duì)ALI的治療，尚無(wú)療效確切的藥物，糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物因其具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、抗休克及增強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用，應(yīng)用于A(yíng)LI的治療，尤其在新型冠狀病毒肺炎導(dǎo)致的ALI中被廣泛應(yīng)用[12]。研究表明，地塞米松通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞活化，在LPS誘導(dǎo)的炎癥和ALI中發(fā)揮保護(hù)作用[13]。故本研究選用地塞米松為陽(yáng)性對(duì)照藥物，從肺泡巨噬細(xì)胞M2極化的角度來(lái)對(duì)比其與麻黃-大黃藥對(duì)對(duì)ALI的影響。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)外界刺激的第一道防線(xiàn)，在病原微生物的吞噬、抗原提呈等方面發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)有病原微生物入侵時(shí)，肺組織的巨噬細(xì)胞被喚醒并募集循環(huán)中的巨噬細(xì)胞向肺組織遷移，并啟動(dòng)免疫反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠ip LPS后，肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增多，同時(shí)病理組織學(xué)結(jié)果證實(shí)，肺組織發(fā)生了嚴(yán)重的損傷，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[14]。肺泡巨噬細(xì)胞在吞噬入侵肺組織病原微生物的同時(shí)也分泌多種細(xì)胞因子，通過(guò)不同途徑啟動(dòng)免疫炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)著炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[15]。當(dāng)病原微生物入侵時(shí)，肺泡巨噬細(xì)胞向M1極化，在吞噬入侵者的同時(shí)，釋放炎癥因子，促發(fā)炎癥反應(yīng)，從而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)以盡快應(yīng)對(duì)外來(lái)的刺激。然而肺泡巨噬細(xì)胞過(guò)度的M1極化則導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，造成肺組織損傷，由此看來(lái)，肺泡巨噬細(xì)胞似乎是導(dǎo)致ALI的罪魁禍?zhǔn)住Ｈ欢?，肺泡巨噬?xì)胞會(huì)根據(jù)環(huán)境的改變而轉(zhuǎn)換其極化表型，當(dāng)病原微生物被逐漸清除，肺泡巨噬細(xì)胞則逐漸向M2型極化，釋放抑炎因子，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)受損組織修復(fù)。本研究結(jié)果表明，大鼠ip LPS后，F(xiàn)4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞增多的同時(shí)，CD206標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)也部分增強(qiáng)，但由于M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量有限，仍不能有效地抑制炎癥反應(yīng)，因此，促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞的M2極化是對(duì)抗M1極化，抑制炎癥反應(yīng)的有效途徑之一。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01，下圖同

圖5 各組大鼠肺組織IL-10和Arg-1 mRNA表達(dá)(, n = 6)

圖6 各組大鼠肺組織IL-10和Arg-1蛋白表達(dá)(, n = 6)

肺腸合治法是中醫(yī)臨床治療肺系疾病的經(jīng)典治法，通常采用宣肺與通腸藥物配伍，針對(duì)ALI初期肺熱腑實(shí)證療效顯著[16-17]。本課題組前期研究肺腸合治法治療ALI的作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)體現(xiàn)肺腸合治的麻黃湯和大承氣湯聯(lián)合應(yīng)用具有顯著的抑制炎癥反應(yīng)、改善肺水腫的作用[18-19]。麻黃、大黃分別是麻黃湯和大承氣湯中的君藥，2藥根據(jù)《方劑學(xué)》麻黃湯和大承氣湯中用量分別為9、12 g[20]，故本研究選用麻黃-大黃藥對(duì)依照前期藥物劑量比3∶4來(lái)探索其對(duì)ALI大鼠的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)麻黃-大黃藥對(duì)及地塞米松均可明顯改善ALI大鼠的肺組織損傷，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減少肺泡巨噬細(xì)胞活化，改善間質(zhì)水腫和肺組織結(jié)構(gòu)紊亂等病理狀態(tài)。免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)麻黃-大黃藥對(duì)能抑制肺泡巨噬細(xì)胞的活化并促進(jìn)其向M2型極化。

IL-10和Arg-1同屬于M2型巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，因此也被用來(lái)作為M2巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物[21]。IL-10是一種多效性細(xì)胞因子，可以在多種類(lèi)型細(xì)胞中發(fā)揮免疫抑制或免疫刺激的作用。在炎癥反應(yīng)方面，IL-10能通過(guò)下調(diào)單核細(xì)胞表面主要組織相容性抗原II的表達(dá)，降低其抗原呈遞作用，下調(diào)T淋巴細(xì)胞活性，抑制炎性細(xì)胞的激活、遷移和黏附；同時(shí)IL-10也能抑制炎癥因子的合成與釋放，內(nèi)源性與外源性IL-10均能在轉(zhuǎn)錄水平強(qiáng)烈抑制IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞集落刺激因子的合成，從而起到抗炎的作用[22]。Arg-1可促使精氨酸降解為脯氨酸，而脯氨酸是膠原蛋白合成的基礎(chǔ)物質(zhì)，在促進(jìn)損傷肺組織修復(fù)方面發(fā)揮了重要的作用[23]。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果證實(shí)，麻黃-大黃藥對(duì)在促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞M2極化的同時(shí)，還能促進(jìn)IL-10的表達(dá)，且IL-10與CD206呈共表達(dá)，這一結(jié)果證實(shí)IL-10的增多與AM的M2極化相關(guān)，隨后的qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，麻黃-大黃藥對(duì)能提高肺組織和mRNA和蛋白表達(dá)水平。

本研究結(jié)果顯示，麻黃-大黃藥對(duì)可改善ALI大鼠肺組織炎癥損傷，減少肺泡巨噬細(xì)胞的活化，同時(shí)促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型極化，促進(jìn)抗炎因子IL-10和組織修復(fù)因子Arg-1的激活與釋放。本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松雖然能部分改善ALI大鼠肺組織病理變化，但對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞M2極化沒(méi)有明顯的影響，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)將含有地塞米松的脂質(zhì)體遞送到炎癥部位的巨噬細(xì)胞中，會(huì)抑制纖維化肺組織中肺泡巨噬細(xì)胞的M2極化，降低肺組織中IL-10和Arg-1水平[24]。在急性炎癥發(fā)生時(shí)，為了應(yīng)對(duì)炎癥反應(yīng)的加劇，在巨噬細(xì)胞M1極化增強(qiáng)的同時(shí)，M2極化也會(huì)適應(yīng)性的增強(qiáng)，以應(yīng)對(duì)炎癥反應(yīng)[25]。因此地塞米松在抑制巨噬細(xì)胞M1極化，減輕炎癥反應(yīng)的同時(shí)也抑制了肺泡巨噬細(xì)胞M2極化。本研究?jī)H觀(guān)察了麻黃-大黃對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞M2極化的影響，其促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞的M2極化機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism ofet Rhizoma drug pair on treating acute lung injury based on alveolar macrophage M2 polarization

WANG Xu-hong1, YAN Shu-guang2, HUI Yi2, SHI Jie1, LI Jing-tao3

1.Department of Respiratory, Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, China 2.College of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 3.Department of Infectious Disease, Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712000, China

To investigate the regulatory effect and mechanism of Mahuang ()-Dahuang (et) drug pair (MD) on polarization of alternatively activated macrophages (M2) in rats with acute lung injury (ALI).Wistar rats were randomly divided into control group, model group, MD low-, medium-and high-dose (2.2, 4.4, 8.8 g/kg) groups and dexamethasone (5 mg/kg) group.Lipopolysaccharide (LPS) was used to prepare ALI model, and drug intervention was given immediately after modeling, and hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of lung tissue; Immunofluorescence double-labeling method was used to detect alveolar macrophage marker F4/80 and M2 marker CD206, as well as the co-expression of F4/80 and interleukin-10 (IL-10); Flow cytometry was used to detect the changes in number of F4/80 and CD206 positive macrophages in lung tissue; Arginase-1 () andmRNA expressions in lung tissue were detected by qRT-PCR; Arg-1 and IL-10 protein expressions in lung tissue were detected by Western blotting.Compared with control group, alveolar structure in lung tissue of rats in model group was destroyed, pulmonary interstitial edema was thickened, inflammatory cells were aggregated and infiltrated, and number of macrophages was significantly increased; The results of immunohistochemistry and flow cytometry confirmed that number and expression of alveolar macrophages were increased, expression and number of M2 macrophages were increased; mRNA and protein expressions of M2 alveolar macrophage-related cytokines IL-10 and Arg-1 were significantly increased (< 0.01).Compared with model group, pathological state of lung tissue in MD high- and medium-dose groups were significantly improved, number of M2 alveolar macrophages in lung tissue was further increased, protein and mRNA expressions of anti-inflammatory factor IL-10 and pro-repair factor Arg-1 were significantly up-regulated (< 0.01).MD can promote M2 polarization of alveolar macrophages, increase the activation and release of anti-inflammatory factors, and inhibit the inflammatory response, thereby treating ALI.

-etdrug pair; acute lung injury; alveolar macrophage; M2 polarization; inflammation response

R285.5

A

0253 - 2670(2022)09 - 2715 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.014

2022-01-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81703974）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（2021JM-473）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)科創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（2019-YL05） Tel: 15829448148 E-mail: doctorwangxh@163.com

通信作者：史 捷（1978—），女，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: 2780067265@qq.com

李京濤（1980—），男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療感染性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail: Lijingtao555@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]