覃列豪，周韜，李敬堯，廉瑞，李晨京，王春玲

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

黃豆醬，又名豆醬、大豆醬，是一種集調(diào)味、營(yíng)養(yǎng)于一體的傳統(tǒng)調(diào)味品，其營(yíng)養(yǎng)豐富、色香味獨(dú)特[1]。黃豆醬的主要原料為面粉和黃豆，加入米曲霉等微生物制成大曲，再加入一定濃度的鹽水進(jìn)行控溫發(fā)酵制成半流動(dòng)態(tài)食品[2-3]。黃豆醬含有豐富的膳食纖維、低聚糖、大豆異黃酮、皂苷、多酚等營(yíng)養(yǎng)成分[4]。但黃豆醬在實(shí)際生產(chǎn)中仍存在一些問(wèn)題，隨著貨架期的延長(zhǎng)，通常會(huì)出現(xiàn)一些白點(diǎn)類物質(zhì)，這不僅嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的質(zhì)量，而且降低了消費(fèi)者的購(gòu)買欲[5]。

前期的研究中認(rèn)為這些白點(diǎn)可能是由微生物污染、酪氨酸結(jié)晶[6]、蛋白質(zhì)過(guò)度水解等原因造成的，酪氨酸結(jié)晶形成主要是由于發(fā)酵過(guò)程中酶系作用于原料物質(zhì)，產(chǎn)生氨基酸、肽等小分子物質(zhì)，在后續(xù)水解反應(yīng)中由于酪氨酸羧肽酶作用形成酪氨酸，隨著反應(yīng)進(jìn)行，酪氨酸過(guò)飽和形成結(jié)晶析出。而過(guò)飽和的狀態(tài)受環(huán)境的pH[7]、溫度以及高溫蒸煮條件下豆粕蛋白質(zhì)變性程度[8]和豆粕周圍滲透壓環(huán)境等多種因素影響。本研究主要以黃豆醬為研究對(duì)象，對(duì)市售黃豆醬中的白點(diǎn)物質(zhì)成分進(jìn)行分析，在明確其主要成分的基礎(chǔ)上通過(guò)優(yōu)化工藝減少白點(diǎn)的形成，提升黃豆醬的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

菌種：米曲霉滬釀3.042，由天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.2 試劑

草酸、乙酸、富馬酸、甲酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸、乳酸：均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；酪氨酸：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CH4O：博歐特(天津)化工貿(mào)易有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC-20A 型高效液相色譜儀 日本島津公司；KDN-08B定氮儀 上海新家儀器有限公司；Multiskan Go酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司；自動(dòng)電位滴定儀 Mettler Toledo公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 白點(diǎn)微生物檢測(cè)

挑取白點(diǎn)物質(zhì)于無(wú)菌生理鹽水中，經(jīng)搖床振蕩后制成懸浮液，分別向細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基中加入100 μL懸浮液后均勻涂布，同時(shí)取未處理的白點(diǎn)物質(zhì)接種于細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度分別為30 ℃和37 ℃，同時(shí)培養(yǎng)3 d后觀察菌落形成情況。

1.4.2 氨基酸組成分析

稱取0.5 g豆醬中白點(diǎn)樣品于燒杯中，加入少量5%三氯乙酸使其溶解，然后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并用0.4 mol/L TCA定容，靜置使白點(diǎn)充分溶解后用雙層濾紙過(guò)濾，濾液為待測(cè)樣品，參照文獻(xiàn)[9]中的方法對(duì)氨基酸進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 蛋白水解度測(cè)定

DH、TCA-NSI的測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]中的方法。

1.4.4 羧肽酶酶學(xué)性質(zhì)研究

粗酶液制備、標(biāo)曲繪制和酶活測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]中的方法。

1.4.5 理化指標(biāo)測(cè)定

總酸含量的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456-2008；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.235-2016。

1.4.6 有機(jī)酸含量測(cè)定

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、流動(dòng)相的配制、液相參數(shù)設(shè)定以及定性方法參照文獻(xiàn)[12-13]中的方法。

1.5 分析方法

利用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Origin軟件畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃豆醬白點(diǎn)微生物檢測(cè)結(jié)果

從帶有白點(diǎn)物質(zhì)的黃豆醬中挑取出白點(diǎn)物質(zhì)，將這些白點(diǎn)物質(zhì)制備成懸浮液后利用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，結(jié)果顯示挑取的白點(diǎn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基培養(yǎng)后都沒(méi)有菌落形成，說(shuō)明黃豆醬白點(diǎn)不是由微生物污染造成的。

2.2 氨基酸組成分析

2.2.1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

將天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸等17種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣20 L，得到混標(biāo)的液相圖譜，見(jiàn)圖1。

圖1 氨基酸混標(biāo)圖譜Fig.1 Chromatogram of amino acid mixed standard samples注：1為天冬氨酸；2為谷氨酸；3為絲氨酸；4為精氨酸；5為甘氨酸；6為蘇氨酸；7為脯氨酸；8為丙氨酸；9為纈氨酸；10為甲硫氨酸；11為半胱氨酸；12為異亮氨酸；13為亮氨酸；14為苯丙氨酸；15為組氨酸；16為賴氨酸；17為酪氨酸。

2.2.2 黃豆醬白點(diǎn)樣品液相圖

黃豆醬白點(diǎn)經(jīng)高效液相色譜分析所得結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 白點(diǎn)樣品液相圖Fig.2 Liquid chromatogram of white spot samples

高效液相色譜圖表明白點(diǎn)的主要成分是酪氨酸，占87.25%，其他氨基酸占4.44%。未能通過(guò)出峰時(shí)間匹配標(biāo)準(zhǔn)品的8.31%推測(cè)為雜質(zhì)，分析其原因是白點(diǎn)經(jīng)常出現(xiàn)在黃豆皮、辣椒籽等的表面，在挑取白點(diǎn)的時(shí)候很難避免這些雜質(zhì)進(jìn)入。根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果將酪氨酸作為后續(xù)研究對(duì)象。

2.3 黃豆醬白點(diǎn)形成的影響因素研究

分別對(duì)有白點(diǎn)和無(wú)白點(diǎn)的黃豆醬設(shè)置3個(gè)平行，進(jìn)行TCA-NSI(三氯乙酸-氮溶指數(shù))、DH(蛋白水解度)以及酪氨酸含量顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。有無(wú)白點(diǎn)黃豆醬的TCA-NSI、DH和酪氨酸含量的顯著性水平P值均低于0.05，表明兩種豆醬在這3種指標(biāo)上均有顯著性差異，可以認(rèn)為黃豆醬白點(diǎn)的形成與TCA-NSI和蛋白質(zhì)水解度有著一定關(guān)聯(lián)，而且DH和TCA-NSI都代表蛋白水解的程度，酪氨酸生成和蛋白水解程度直接相關(guān)，而酪氨酸結(jié)晶會(huì)促使白點(diǎn)形成，因此研究蛋白水解程度為提出控制白點(diǎn)產(chǎn)生的措施提供了參考依據(jù)。

表1 有無(wú)白點(diǎn)黃豆醬蛋白水解度對(duì)比Table 1 The comparison of protein hydrolysis degree of soybean paste with and without white spots

2.4 羧肽酶學(xué)性質(zhì)的研究

黃豆醬白點(diǎn)中內(nèi)肽酶和外肽酶共同促使酪氨酸生成，外肽酶的作用尤其重要，外肽酶作用于酪氨酸末端，從肽鏈上切下酪氨酸，形成游離酪氨酸。這種外肽酶包括酪氨酸羧肽酶，具有廣泛的作用位點(diǎn)，可以水解疏水性氨基酸[14-15]。因此，將酪氨酸羧肽酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果作為黃豆醬發(fā)酵工藝優(yōu)化的依據(jù)，對(duì)于降低酪氨酸生成十分重要。

以Z-Gly-Tyr二肽為底物，探究溫度對(duì)酪氨酸羧肽酶酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 溫度對(duì)酪氨酸羧肽酶活力的影響Fig.3 The effect of temperature on the activity of tyrosine carboxypeptidase

圖4 不同溫度下保溫不同時(shí)間對(duì)羧肽酶的影響Fig.4 The effect of different holding time at different temperatures on carboxypeptidase

由圖3可知，當(dāng)水浴溫度為25～40 ℃時(shí)，酶活變化與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢(shì)，酶活隨著溫度的升高而上升，當(dāng)溫度上升至40 ℃時(shí)酶活達(dá)到最高。而當(dāng)溫度升高至40 ℃之后則和溫度呈負(fù)相關(guān)，這可能是由于溫度升高影響了酶的空間結(jié)構(gòu)，使得酪氨酸羧肽酶酶活下降。因此，將發(fā)酵溫度控制在25～35 ℃、40～45 ℃時(shí)酶活可以得到有效控制。

通過(guò)對(duì)該羧肽酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，由圖4可知，在25～45 ℃水浴中放置大約2 h之后，酶活仍然具有可以保持在超過(guò)70%相對(duì)酶活的能力，說(shuō)明酶在此溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好，而50 ℃水浴0.5 h后相對(duì)酶活開(kāi)始下降，因此溫度實(shí)驗(yàn)為后續(xù)選擇合適的發(fā)酵溫度提供了依據(jù)。

2.5 原料配比對(duì)白點(diǎn)產(chǎn)生的影響

2.5.1 不同原料配比下酪氨酸羧肽酶酶活測(cè)定

原料是黃豆醬生產(chǎn)的基礎(chǔ)，選擇合適的原料配比是提高黃豆醬質(zhì)量的重要措施之一。蛋白質(zhì)原料和淀粉質(zhì)原料在微生物酶的作用下經(jīng)過(guò)復(fù)雜的代謝過(guò)程形成黃豆醬的特殊風(fēng)味[16]。酪氨酸羧肽酶是蛋白酶系中的一種，主要影響酪氨酸的形成，不同配比底物提供的碳源和氮源影響了微生物酶的代謝[17]，勢(shì)必會(huì)造成酪氨酸羧肽酶酶活的差異。黃豆與面粉按5∶5、6∶4和7∶3配比的大曲酪氨酸羧肽酶活力對(duì)比見(jiàn)圖5，整體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中36 h時(shí)酶活力達(dá)到最高，分別為335.46，329.51，264.99 U/g，3種配比中7∶3時(shí)酶活最低。

圖5 不同配比下酪氨酸羧肽酶活力的變化Fig.5 Changes in the activity of tyrosine carboxypeptidase under different ratios

2.5.2 不同原料配比下理化指標(biāo)測(cè)定

黃豆醬在釀造過(guò)程中，大豆中的蛋白質(zhì)被微生物和各種酶作用分解成氨基酸、多肽等一類可溶性含氮化合物；面粉被分解成了各種糖類：?jiǎn)翁?、雙糖和多糖；當(dāng)溫度適宜時(shí)，氨基酸會(huì)和糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成棕褐色物質(zhì)。所以實(shí)驗(yàn)跟蹤測(cè)定了黃豆醬的pH、總酸、氨基酸態(tài)氮理化指標(biāo)。

2.5.2.1 總酸測(cè)定

由于在發(fā)酵過(guò)程中一些碳水化合物會(huì)被米曲霉分解產(chǎn)生一些有機(jī)酸，微生物細(xì)胞降解自溶后會(huì)積累游離脂肪酸，還包括各種氨基酸的生成，使得各種酸類物質(zhì)不斷生成，總酸含量升高[18]。而如果最終總酸含量過(guò)多，很可能是一些耐溫產(chǎn)酸的微生物存在于醬醪中，使得總酸大量積累。過(guò)多的酸類對(duì)黃豆醬的口感也會(huì)產(chǎn)生不良影響，因此在實(shí)際生產(chǎn)中盡量避免這種情況的發(fā)生。為此，實(shí)驗(yàn)跟蹤測(cè)定了3種原料配比下黃豆醬總酸含量。對(duì)比圖6中3種原料配比，其中黃豆與面粉按7∶3配比時(shí)總酸含量最高，為1.72 g/100 g，其余兩個(gè)配比總酸含量分別為1.49，1.53 g/100 g，三者皆滿足了黃豆醬國(guó)標(biāo)中對(duì)總酸含量≤2.0 g/100 g的要求。

圖6 不同配比下發(fā)酵期間總酸含量的變化Fig.6 Changes in the content of total acids during fermentation under different ratios

2.5.2.2 pH測(cè)定

由圖7可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，pH呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，前期下降速度快，后期基本持平。pH出現(xiàn)變化的原因和總酸類似。3種配比下發(fā)酵終端pH分別降低至4.88，4.95，4.80，均在正常發(fā)酵范圍內(nèi)。

圖7 不同配比下發(fā)酵期間pH的變化Fig.7 Changes in pH values during fermentation under different ratios

2.5.2.3 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮主要指以氨基酸狀態(tài)存在的氮元素含量，是國(guó)標(biāo)中評(píng)價(jià)黃豆醬質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[19]。氨基酸的生成豐富了黃豆醬的風(fēng)味，如天冬氨酸和谷氨酸構(gòu)成了黃豆醬的鮮味，除此之外，還含有甜味、酸味、苦味氨基酸[20]。

由圖8可知，大豆含量越高，氨基酸態(tài)氮含量越高。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，不同原料配比的黃豆醬氨基酸態(tài)氮含量均呈上升趨勢(shì)，配比為7∶3的氨基酸態(tài)氮含量最高，黃豆醬發(fā)酵10 d后上升緩慢是由于一部分氨基酸態(tài)氮與還原糖發(fā)生了羰氨反應(yīng)，使得部分氨基酸態(tài)氮被消耗。由于生成量大于消耗量，所以氨基酸態(tài)氮還處于上升趨勢(shì)，發(fā)酵終端各原料配比的氨基酸態(tài)氮含量分別為0.67，0.78，0.81 g/100 g，滿足了黃豆醬國(guó)標(biāo)中對(duì)氨基酸態(tài)氮含量≥0.5 g/100 g的要求。

圖8 不同配比下發(fā)酵期間氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.8 Changes in amino acid nitrogen content during fermentation under different ratios

3 結(jié)論

根據(jù)微生物檢測(cè)結(jié)果可知白點(diǎn)不是由于微生物污染造成的。經(jīng)高效液相色譜分析，測(cè)得白點(diǎn)物質(zhì)含有17種氨基酸，其中酪氨酸占87.25%，所以可以判斷白點(diǎn)物質(zhì)的主體物為酪氨酸。對(duì)黃豆醬白點(diǎn)性質(zhì)研究結(jié)果顯示，有白點(diǎn)的黃豆醬蛋白水解度明顯高于無(wú)白點(diǎn)的黃豆醬，酪氨酸含量也較高，二者之間存在顯著關(guān)聯(lián)，因此推測(cè)白點(diǎn)的生成與蛋白過(guò)度水解有一定的關(guān)系。羧肽酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，當(dāng)溫度在30～35 ℃、40～45 ℃時(shí)酶活較低，并且相對(duì)酶活在3 h內(nèi)仍能夠保持在70%以上，黃豆與面粉按7∶3配比時(shí)酶活最低，該配比下發(fā)酵終端總酸1.72 g/100 g滿足黃豆醬國(guó)標(biāo)中總酸含量≤2.0 g/100 g的要求；pH 4.8在黃豆醬正常發(fā)酵范圍內(nèi)；氨基酸態(tài)氮0.81 g/100 g滿足黃豆醬國(guó)標(biāo)氨基酸態(tài)氮含量≥0.5 g/100 g的要求，且在3種配比下含量最高，終端醬醪未發(fā)現(xiàn)白點(diǎn)類物質(zhì)生成。