張如婧， 廖常希， 徐美妹， 王志蘋， 林華

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶之一，C677T和A1298C是該酶基因常見的兩個(gè)突變位點(diǎn)，其中C677T位點(diǎn)胞嘧啶轉(zhuǎn)胸腺嘧啶突變使酶對(duì)熱不穩(wěn)定而降低活性，可引起葉酸利用障礙[1]。葉酸的缺乏或葉酸利用能力的下降將導(dǎo)致血漿中同型半胱氨酸(homocysteine， HCY)轉(zhuǎn)化異常而蓄積，引起高HCY血癥[2]。多項(xiàng)研究表明，MTHFRC677T多態(tài)性及高HCY血癥與胎兒神經(jīng)管缺陷、先天性心臟病、唇腭裂等不良妊娠結(jié)局關(guān)系密切[3-6]。

中國疆域遼闊，MTHFRC677T多態(tài)性在不同地區(qū)差異顯著[7]。筆者以莆田地區(qū)育齡女性為研究對(duì)象，通過測(cè)定血清HCY濃度，分析MTHFRC677T基因遺傳特征對(duì)HCY濃度的影響，為圍孕期女性科學(xué)增補(bǔ)葉酸提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2019年2月—2021年5月在莆田學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行婚、孕前檢查的漢族育齡女性608例，年齡(28.15±4.65)歲(19～42歲)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)籍貫非莆田市；(2)有高血壓病家族遺傳病史；(3)近2周服用過葉酸、維生素B等營養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物。本研究經(jīng)莆田學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(莆醫(yī)附倫[2021027])，患者或親屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器MTHFRC677T基因檢測(cè)試劑盒(西安金磁納米生物技術(shù)有限公司)，HCY試劑盒(浙江康特生物科技有限公司)，PCR儀(ABI 7500型，美國Life公司)，全自動(dòng)生化分析儀(E170型，羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)。

1.2.2 基因組DNA模板的獲取 靜脈采集研究對(duì)象的EDTA-K2抗凝全血2 mL，混勻后取10 μL全血與20 μLMTHFRC677T基因檢測(cè)試劑盒中配套的樣本稀釋液旋渦混勻。待血液變?yōu)榘导t色時(shí)，即可作為模板液進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，注意處理后的稀釋樣本需在5 min內(nèi)加入PCR反應(yīng)體系。

1.2.3MTHFRC677T基因擴(kuò)增 取5 μL模板液分別加入45 μL含突變T基因特異引物的“M擴(kuò)增液”或含野生C基因特異引物的“WT擴(kuò)增液”PCR反應(yīng)體系，基于MTHFRC677T基因突變位點(diǎn)的引物標(biāo)記與特異性PCR擴(kuò)增，獲得標(biāo)記有地高辛分子的特定擴(kuò)增片段，擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min；95 ℃ 3.5 min；94 ℃ 5 s→60 ℃ 10 s→65 ℃ 30 s，31個(gè)循環(huán)；65 ℃ 10 min；4 ℃ 維持。

1.2.4MTHFRC677T基因分型判讀 取40 μL“M擴(kuò)增產(chǎn)物”或“WT擴(kuò)增產(chǎn)物”加于納米金磁微粒檢測(cè)卡的對(duì)應(yīng)樣品墊處，基于地高辛標(biāo)記抗體反應(yīng)，通過側(cè)向流層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)MTHFRC677T基因多態(tài)性的檢測(cè)，待5 min后對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，20 min 內(nèi)判讀有效。MTHFRC677T基因分型判讀方法見圖1。

M：突變T基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)條；WT：野生C基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)條。圖1 MTHFR C677T基因檢測(cè)卡結(jié)果判讀Fig.1 Interpretation of the results of MTHFR C677T gene detection card

1.2.5 血清HCY含量檢測(cè) 靜脈采集肝素抗凝全血2 mL，2 808 ×g離心3 min，吸取0.5 mL血清于反應(yīng)杯中，置于E170全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血清HCY水平(循環(huán)酶法)，每批測(cè)定前的定標(biāo)與質(zhì)控均為配套試劑。

1.3 其他地區(qū)MTHFRC677T多態(tài)性數(shù)據(jù)的獲取 在數(shù)據(jù)庫MEDLINE、中國知網(wǎng)、萬方、維普上檢索國內(nèi)其他地區(qū)漢族育齡女性MTHFRC677T多態(tài)性數(shù)據(jù)，中文關(guān)鍵詞“亞甲基四氫葉酸還原酶”“基因多態(tài)性”，英文關(guān)鍵詞“MTHFR”“polymorphisms”。文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)2020—2021年發(fā)表；(2)可體現(xiàn)當(dāng)?shù)貪h族育齡女性MTHFRC677T各基因型頻數(shù)；(3)研究中MTHFRC677T多態(tài)性數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinberg平衡定律。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)數(shù)據(jù)不全；(2)納入樣本帶有隨機(jī)性影響，如病例對(duì)照研究。若同一省內(nèi)含不止1項(xiàng)符合標(biāo)準(zhǔn)的研究，擇取高質(zhì)量且樣本量較大的文獻(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡 共納入608例病例，以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)對(duì)莆田地區(qū)MTHFRC677T位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，χ2=2.103(P>0.05，表1)，表明該樣本MTHFRC677T位點(diǎn)分布特點(diǎn)具有莆田地區(qū)群體代表性。

表1 MTHFR C677T基因分布的Hardy-Weinberg檢驗(yàn)Tab.1 Hardy-Weinberg test of MTHFRC677T gene distribution

2.2MTHFRC677T位點(diǎn)基因分布情況 608例中，MTHFRC677T以野生CC型為優(yōu)勢(shì)基因型，占比47.9%(291例)，雜合CT型和純合TT型分別占比40.8%(248例)和11.3%(69例)，突變 T基因頻率為31.7%。3種基因型分布與省內(nèi)已有報(bào)道的廈門地區(qū)育齡女性數(shù)據(jù)比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與廣東廣州地區(qū)相似，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與河南鄭州、河北廊坊、內(nèi)蒙古赤峰、新疆塔城、陜西延安、上海、四川樂山、湖北武漢、浙江臺(tái)州、貴州貴陽、江西新余、云南大理地區(qū)比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。本研究中莆田地區(qū)T基因頻率與同樣以純合CC型為主的福建廈門、廣東廣州地區(qū)比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而顯著低于以雜合CT基因型為主的其他地區(qū)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

表2 莆田地區(qū)與其他地區(qū)育齡女性MTHFR C677T位點(diǎn)基因分布比較Tab.2 Comparison of MTHFR C677T gene distribution between childbearing women in Putian city and other regions

2.3MTHFRC677T不同基因型與HCY水平的關(guān)系 對(duì)研究樣本的HCY濃度測(cè)定顯示，血清HCY水平隨著MTHFRC677T位點(diǎn)突變程度的增加而增加。野生CC、雜合突變CT、純合突變TT基因型育齡女性HCY水平分別為(8.48±2.32)、(9.14±3.38)及(12.68±4.71) μmol/L。單因素方差分析顯示，組間HCY水平比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.778，P=0.000)。進(jìn)一步行SNK檢驗(yàn)兩兩比較顯示，雜合CT基因型與純合突變TT基因型血清HCY水平顯著高于野生CC型，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雜合CT基因型血清HCY水平略高于純合CC基因型，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶基因；HCY：同型半胱氨酸；CC：純合野生型；CT：雜合突變型；TT：純合突變型。MTHFR C677T CC、CT分別與TT比較，#：P<0.05。圖2 MTHFR C677T不同基因型的HCY水平Fig.2 HCY levels of different MTHFR C677T genotypes

3 討 論

MTHFR在參與葉酸的代謝、促進(jìn)HCY的轉(zhuǎn)化及DNA合成中發(fā)揮重要作用，其中C677T為MTHFR基因最常見的堿基突變位點(diǎn)。有研究表明，攜帶雜合CT突變的MTHFR活性為純合CC型的65%，而純合TT突變者該酶活性降至30%[22]。若純合突變MTHFR677TT基因型孕婦葉酸攝入不足，血清內(nèi)HCY水平或?qū)⑸?，生育出生缺陷患兒風(fēng)險(xiǎn)也將大大增加。適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充葉酸是降低出生缺陷的經(jīng)濟(jì)高效方法，現(xiàn)已成為全球性的公共衛(wèi)生干預(yù)措施。然而，過多的葉酸攝入或?qū)⒀谏w維生素B12缺乏引起的惡性貧血，也可能增加妊娠期糖尿病、嬰兒哮喘等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[23-25]。因此，明確各地區(qū)MTHFR基因分布特征和葉酸代謝能力，及該遺傳特點(diǎn)對(duì)HCY水平的影響，對(duì)各地育齡女性合理增補(bǔ)葉酸的指導(dǎo)尤為重要。

以文中參考的幾個(gè)地區(qū)數(shù)據(jù)來看，福建廈門、廣東廣州地區(qū)漢族育齡女性以野生CC基因型為主，其余地區(qū)以CT雜合突變?yōu)閮?yōu)勢(shì)基因型，總體上突變T等位基因頻率自南向北逐漸遞增。筆者首次對(duì)莆田地區(qū)育齡女性MTHFRC677T位點(diǎn)多態(tài)性分析，與省內(nèi)已報(bào)道的廈門地區(qū)該基因多態(tài)性差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]，在補(bǔ)充福建省遺傳數(shù)據(jù)庫的同時(shí)，也表明了該基因分布或具有福建地區(qū)代表性。本研究中，莆田地區(qū)突變T基因頻率低于華南以北地區(qū)的特點(diǎn)，恰好符合國內(nèi)突變T基因自南向北增高的整體趨勢(shì)。各地區(qū)MTHFR基因分布的大幅度差別，或是導(dǎo)致常規(guī)葉酸補(bǔ)充預(yù)防出生缺陷效果差別的重要原因，也可解釋中國南方地區(qū)神經(jīng)管畸形出生缺陷低于北方地區(qū)的特點(diǎn)[26]。

現(xiàn)已明確高水平的HCY可使甲基轉(zhuǎn)移酶受抑制出現(xiàn)低甲基化，易造成染色體分離障礙，可能與先兆子癇、早產(chǎn)、胎盤早剝、胎兒生長受限等妊娠并發(fā)癥相關(guān)[27-31]。中國婦幼保健協(xié)會(huì)建議高HCY血癥婦女每日增補(bǔ)至少5 mg葉酸，直至HCY降至正常后再考慮受孕，在葉酸增補(bǔ)基礎(chǔ)上每日補(bǔ)充維生素B12可進(jìn)一步降低HCY水平[32]?；谌~酸0.7 h的生物半衰期，本課題研究對(duì)象排除了近2周有補(bǔ)充葉酸、維生素B的育齡女性，以及可能影響HCY濃度的高血壓家族遺傳病史者，目的為在盡量降低該研究選擇偏倚的情況下檢測(cè)血清HCY的基線水平[33]。本研究中，純合突變TT基因型的HCY水平顯著高于野生CC型和雜合CT型，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了MTHFR基因突變對(duì)血漿中HCY濃度的影響。中國婦幼保健協(xié)會(huì)《圍受孕期增補(bǔ)葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷指南》與加拿大婦科醫(yī)師協(xié)會(huì)關(guān)于孕期補(bǔ)充葉酸的指南均提出針對(duì)不同MTHFRC677T基因型及HCY水平的葉酸補(bǔ)充方案[32,34]。在無條件進(jìn)行MTHFR基因檢測(cè)的基層地區(qū)或人群，HCY檢測(cè)或可輔助指導(dǎo)圍孕期女性的葉酸補(bǔ)充，在達(dá)到較好出生缺陷預(yù)防效果的同時(shí)，降低過量補(bǔ)充葉酸的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，MTHFRC677T是出生缺陷易感的重要基因，各地該基因多態(tài)性存在很大差別，其遺傳特征所致葉酸利用能力差別使得常規(guī)的葉酸補(bǔ)充無法滿足所有圍孕期女性的需求。本研究豐富了福建省MTHFRC677T多態(tài)性遺傳信息庫，針對(duì)育齡女性進(jìn)行葉酸代謝基因MTHFR的檢測(cè)或在孕期進(jìn)行HCY水平的監(jiān)測(cè)，并予以個(gè)體化的葉酸補(bǔ)充，或?qū)⒏珳?zhǔn)地達(dá)到降低出生缺陷、優(yōu)生優(yōu)育的目的。