姚瑞祺,胡家棟,王 鋒,周 博

楊凌職業(yè)技術學院,楊凌 712100

山茱萸是我國傳統(tǒng)中藥材,是山茱萸科植物山茱萸（CornusofficinalisSieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉,主產(chǎn)于陜西、河南和浙江等省[1],具有補益肝腎、澀精固脫的功效[2-3]。山茱萸多糖是山茱萸中重要的活性成分,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),其對動物免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)疾病均有一定的治療和預防作用[4-6],應用前景十分廣闊。水提醇沉法是植物多糖的常用提取方法,操作安全、簡單,無須大功率提取設備,在生產(chǎn)中應用較多[7-9],但其缺點是提取所需時間較長、多糖得率較低。超聲波輔助提取是近年來常用的提取技術,可縮短提取時間、提高產(chǎn)品得率、降低活性物質被破壞的可能性[10-11]。本研究利用超聲波輔助提取山茱萸粗多糖,并進行抗氧化活性分析,以期為山茱萸多糖的理論研究和生產(chǎn)應用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2500C 型多功能粉碎機（永康市金穗機械制造廠）;JM-15D-45/80型超聲波提取儀、JM-07D-28/45型超聲波提取儀、JM-20D-28 型超聲波提取儀、JM-16D-80型超聲波提取儀、JM-16D-40 型超聲波提取儀,均購自深圳市潔盟清洗設備有限公司;UV1901PCS型雙光束紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;R1002B 型旋轉蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）;DCM-5M 型離心機（上海赫田科學儀器有限公司）;BSA423S-CW 分析天平（德國賽多利斯集團）。

1.2 試藥

山茱萸（產(chǎn)自陜西省佛坪縣,經(jīng)鑒定為山茱萸科植物CornusofficinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉）;2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（色譜純,美國Sigma公司）;DPPH·（色譜純,美國Sigma公司）;2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT,食品級,江蘇邁達新材料股份有限公司）;苯酚、濃硫酸、葡萄糖、乙醇、FeCl3、FeSO4均為分析純,均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 實驗方案

山茱萸粗多糖的制備工藝流程:山茱萸干粉→粉碎→稱質量→超聲輔助提取→過濾→濃縮→體積分數(shù)為95%的乙醇溶液醇沉→離心→干燥→山茱萸粗多糖。

超聲輔助提取方案:分別稱取50 g山茱萸干粉,按照不同的料液比加入設定溫度（30～55℃）的水中,在設定的超聲波頻率（28、40、80、28/45、45/80 k Hz）和功率（180～360 W）條件下浸提一定時間（30～120 min）。本研究主要考察超聲頻率、超聲功率、料液比、浸提溫度、浸提時間等因素對山茱萸粗多糖提取率的影響。對照組的處理過程與上述方案一致,但不采用超聲波輔助浸提。

準確稱量制備好的山茱萸粗多糖,用蒸餾水溶解,配置成質量濃度為0.05～0.60 mg·mL-1的溶液,進行抗氧化活性分析（對照品為BHT）。

2.2 指標測定方法

2.2.1 山茱萸粗多糖提取率測定 以葡萄糖為對照品,采用苯酚-硫酸法[12]測定樣品山茱萸粗多糖的含量,得出山茱萸粗多糖的提取率。

標準曲線的繪制[13]:分別精密吸取不同體積的葡萄糖供試液,用蒸餾水補充體積至2.0 mL,依次分別加入50 mL·L-1的苯酚和濃硫酸1.0、5.0 mL,搖勻后靜置30 min,用紫外可見分光光度計于波長490 nm處測定吸光度,并繪制標準曲線,得回歸方程。

樣品山茱萸粗多糖含量測定:分別采用苯酚-硫酸法檢測不同提取條件下的樣品山茱萸粗多糖溶液,根據(jù)回歸方程計算樣品山茱萸粗多糖的含量。按照公式W=[（C×D）/M]×100%計算山茱萸粗多糖的提取率。其中C為樣品中山茱萸粗多糖的含量;D為樣品稀釋倍數(shù);M為稱取的山茱萸的質量。

2.2.2 山茱萸抗氧化活性的測定方法 山茱萸抗氧化活性的測定方法有ABTS法和DPPH·法。

ABTS法[14]:取40μL樣品溶液置于96孔板中,加入970μL 2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2,2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）,ABTS]工作液,混勻,在避光條件下靜置6 min,測定在734 nm 處的吸光度;以40μL乙醇溶液為對照;計算不同質量濃度樣品溶液的ABTS自由基清除率,并計算半數(shù)清除質量濃度（IC50）。DPPH·法[15]:在3.0 mL 60μmol·L-1DPPH·乙醇溶液中加入20μL 樣品溶液,搖勻后在25℃放置0.5 h,測定在517 nm 處的吸光度（AS）;以20μL乙醇為對照（A0）;計算不同質量濃度樣品溶液的DPPH·自由基清除率,并計算半數(shù)清除質量濃度（IC50）。

2.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析,結果以平均值±標準差表示。

3 結果

3.1 葡萄糖回歸方程

葡萄糖回歸方程為y=0.011x-0.011,R2=0.999 4。

3.2 單因素實驗研究

3.2.1 超聲頻率對山茱萸粗多糖提取率的影響 不同頻率的超聲波對山茱萸粗多糖提取率的影響見圖1。由圖1可見,與無超聲波對照相比,在每個浸提時間點,有超聲波輔助的山茱萸粗多糖提取率均大于無超聲波對照。在30～105 min范圍內(nèi),隨著浸提時間的延長,山茱萸粗多糖的提取率均呈現(xiàn)上升的趨勢,105 min以后,提取率增速變緩或趨于不變。

圖1 頻率對提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on extraction yield

相關研究的結果[16-17]表明,單頻超聲波的頻率越低,空化作用越明顯,而提取率則越高。這與本實驗得到的結果一致,在3個單頻超聲波處理組中,28 k Hz的提取率最高,之后依次為40和80 k Hz。本實驗發(fā)現(xiàn),在任一浸提時間點上,雙頻組合超聲波（28/45和45/80 k Hz）的山茱萸粗多糖的提取率均優(yōu)于單頻超聲波（28、40和80 k Hz）,其中,28/45 k Hz雙頻組合超聲波的提取率優(yōu)于45/80 k Hz雙頻組合超聲波（P＜0.05）,這可能與樣品的共振頻率相關[18-19]。28/45 k Hz雙頻組合超聲波更接近于山茱萸粗多糖的共振頻率,更容易引起共振現(xiàn)象,從而使山茱萸粗多糖的浸提效果更佳。

3.2.2 料液比對山茱萸粗多糖提取率的影響 不同料液比對山茱萸粗多糖提取率的影響見圖2。由圖2可見,在30～105 min范圍內(nèi),隨著浸提時間的延長,各組山茱萸粗多糖的提取率均穩(wěn)步上升（P＜0.05）;105 min以后,增長漸趨平緩或略有下降（P＞0.05）。1∶6 的料液比在105 min 時提取率達到最高,為18.25%,而此時對照僅為10.82%（P＜0.05）。由此可見,超聲輔助提取山茱萸多糖的效果顯著。

圖2 料液比對提取率的影響Fig.2 Effect of proportion of raw material and water on extraction yield

3.2.3 浸提溫度對山茱萸粗多糖提取率的影響 因考慮到過高的溫度可能會使山茱萸粗多糖的抗氧化活性減弱,故本實驗僅考察了30～55℃的浸提溫度范圍。不同浸提溫度對山茱萸粗多糖提取率的影響見圖3。由圖3可見,在105 min前,不同溫度下的山茱萸粗多糖浸提率均呈現(xiàn)隨著浸提時間的延長浸提率逐漸升高的規(guī)律。50℃為較為理想的浸提溫度,在105 min時山茱萸粗多糖浸提率達到了18.68%;與45和55℃相比,差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;與無超聲對照（9.2%）相比,提取率提升了近1倍。

圖3 溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction yield

3.2.4 浸提功率對山茱萸粗多糖提取率的影響 浸提功率對山茱萸多糖提取率的影響見圖4。由圖4可見,在180～360 W 超聲功率范圍內(nèi),伴隨浸提時間的延長,樣品的提取率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在330 W 的超聲功率作用105 min時,山茱萸粗多糖的提取率最大,達到18.25%;與臨界的300和360 W 相比,差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在180～330 W 范圍內(nèi),隨著超聲功率的提高,山茱萸的提取率也逐漸上升,當超聲功率達到360 W 時,山茱萸粗多糖的提取率反而有所下降。這可能是由于長時間大功率的超聲波作用使部分山茱萸多糖發(fā)生了降解[20]。

圖4 浸提功率對提取率的影響Fig.4 Effect of power on extraction yield

3.3 正交實驗設計

在單因素實驗優(yōu)選數(shù)據(jù)的基礎上,進行正交實驗設計,得出最優(yōu)超聲輔助浸提山茱萸粗多糖工藝。正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平Tab.1 Factors and levers of orthogonal test

正交實驗結果和極差分析結果見表2。由表2可見,影響山茱萸粗多糖提取率的因素依次為超聲頻率（A）＞超聲功率（D）＞料液比（B）＞浸提溫度（C）,最優(yōu)工藝組合為A2D2B2C3,即超聲頻率28/45 k Hz、超聲功率330 W、料液比1∶6、浸提溫度55℃。在此條件下,經(jīng)3次平行實驗驗證,發(fā)現(xiàn)山茱萸粗多糖的提取率為19.15%。

表2 正交實驗結果及極差分析結果Tab.2 Results of orthogonal test and analysis of extreme difference range

方差分析結果見表3。由表3可見,超聲頻率、料液比、超聲功率對山茱萸粗多糖提取率的影響均極為顯著（P＜0.01）,而浸提溫度則為顯著（P＜0.05）。

表3 正交實驗方差分析結果Tab.3 Results of variance analysis of the orthogonal test

3.4 山茱萸粗多糖抗氧化活性研究

山茱萸粗多糖的抗氧化活性采用ABTS 法和DPPH·法進行檢測。IC50值越小,提示清除自由基的能力越強。

BHT 是一種化學合成的抗氧化劑,具有極強的抗氧化作用,對各類自由基均有較強的清除作用,被廣泛應用于食品行業(yè),在生產(chǎn)中可以作為食品添加劑中的抗氧化劑使用[21]。不同質量濃度的山茱萸粗多糖和BHT 對照對ABTS及DPPH·的清除效果分別見圖5和圖6。

3.4.1 ABTS法 由圖5可見,質量濃度在0.02～0.20 mg·mL-1范圍內(nèi)時,BHT 對ABTS的清除率隨質量濃度的增加而呈直線上升的趨勢,當質量濃度繼續(xù)增大時,清除率基本保持不變,維持在90.5%。在同一質量濃度下,雖然山茱萸粗多糖的ABTS清除率低于對照BHT,但隨著質量濃度的增加,其對ABTS自由基的清除率也逐漸升高,當質量濃度達到0.4 mg·mL-1時,曲線趨于平緩,清除率達到65.71%,約為對照BHT 的2/3。經(jīng)曲線模擬計算,山茱萸粗多糖對ABTS的IC50值為0.26 mg·mL-1。

圖5 山茱萸粗多糖和BHT對ABTS自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effects of Cornus officinalis crude polysaccharides and BHT on ABTS free radicals

3.4.2 DPPH·法 DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基,其乙醇溶液為紫色;有自由基清除劑存在時,DPPH·的單電子被捕捉而使其乙醇溶液的顏色變淺,在517 nm 波長處吸光度會有所下降,根據(jù)下降的程度可評價實驗樣品的抗氧化能力。

山茱萸粗多糖和BHT 對DPPH·的清除效果見圖6。由圖6可見,質量濃度在0.05～0.30 mg·mL-1范圍內(nèi)時,BHT對DPPH·的清除率隨質量濃度的增加而增大,直至達到最大清除率（95.24%）;隨后曲線趨于平緩,DPPH·清除率的變化不明顯。山茱萸粗多糖的質量濃度在0.05～0.45 mg·mL-1范圍內(nèi)時,DPPH·的清除率低于BHT,但呈現(xiàn)了質量濃度越大清除率越高的趨勢;當質量濃度超過0.45 mg·mL-1時,山茱萸粗多糖對DPPH·的清除率基本平穩(wěn),達到了最高值（95.70%）,與相同質量濃度BHT的清除率接近。經(jīng)曲線模擬計算,山茱萸粗多糖對DPPH·的IC50值為0.28 mg·mL-1,BHT對DPPH·的IC50值為0.16 mg·mL-1。

圖6 山茱萸粗多糖和BHT對DPPH·的清除效果Fig.6 Scavenging effects of Cornus officinalis crude polysaccharide and BHT on DPPH·

4 結論與討論

超聲波輔助提取可用于山茱萸粗多糖的提取,影響提取率的因素主要有超聲頻率、料液比、浸提溫度、超聲功率等。與無超聲波對照相比,超聲輔助提取能顯著提高山茱萸粗多糖的浸提率。在單因素實驗條件下,雙頻組合超聲波（28/45和45/80 k Hz）的浸提效果優(yōu)于單頻超聲波（28、40和80 k Hz）,且以28/45 k Hz為佳;超聲功率以330 W 為佳。這可能是因為28/45 k Hz雙頻組合超聲波更接近于山茱萸粗多糖的共振頻率,容易引起共振現(xiàn)象;在330 W 功率下,超聲波的能量能最大程度地作用于山茱萸,且未引起多糖的降解,對山茱萸粗多糖的浸提效果更佳。經(jīng)正交實驗,得出超聲輔助提取山茱萸粗多糖的最優(yōu)工藝為超聲頻率28/45 k Hz、超聲功率330 W、料液比1∶6、浸提溫度55℃,在此工藝條件下,山茱萸粗多糖的提取率可達19.15%。

山茱萸粗多糖對ABTS的IC50值為0.26 mg·mL-1,其清除ABTS的能力在質量濃度0～0.4 mg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)質量濃度依賴,即質量濃度越高,清除能力越強;質量濃度在0.4 mg·mL-1以上時,清除率不再繼續(xù)增大,維持在65.71%,約為對照BHT的2/3。山茱萸粗多糖對DPPH·的IC50值為0.28 mg·mL-1,其清除ABTS的能力在質量濃度為0.05～0.45 mg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)質量濃度依賴,質量濃度越高,清除能力越強;質量濃度在0.45 mg·mL-1以上時,清除率不再繼續(xù)增大,維持在95.70%,與對照BHT的最大清除率基本相同。

綜上所述,超聲波輔助提取能有效提高山茱萸粗多糖的提取率,本研究利用單因素和正交實驗篩選出了最佳提取工藝;經(jīng)超聲波輔助浸提制得的山茱萸粗多糖具有較好的抗氧化活性,能有效清除ABTS 和DPPH·自由基。