暴希照,于效超,牛宗帥,付 霖,李 琦

1.安陽市第八人民醫(yī)院泌尿外科,安陽 456150;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科,鄭州 450000

前列腺癌是好發(fā)于中老年男性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤[1]。藥物去勢或手術(shù)治療可在一定程度上緩解前列腺癌患者的病情,但隨著病程的進(jìn)展,大部分患者發(fā)展為去勢抵抗型前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）[2],癌細(xì)胞增殖加速,導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展,病情惡化。前列腺為雄激素依賴性器官,由雄激素和雄激素受體（androgen receptor,AR）介導(dǎo)的信號途徑與前列腺癌的進(jìn)程關(guān)系密切,AR 異常激活是導(dǎo)致CRPC的主要環(huán)節(jié)[3]。因此,內(nèi)源性AR 是治療CRPC的主要靶點(diǎn)。臭椿酮是提取自臭椿的天然小分子化合物。研究顯示[4],臭椿酮對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲具有抑制作用,且呈濃度依賴性,并可促使肺癌裸小鼠腫瘤直徑縮小,提示其具有抗癌功效。本研究通過觀察臭椿酮對前列腺癌22RV1細(xì)胞內(nèi)源性AR 及其下游基因mRNA 表達(dá)的影響,探究其對前列腺癌可能的治療作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、attune nxt流式細(xì)胞儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;37XB型倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）;Spectra Max iD5型酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司];Light Cycler?96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。

1.2 試藥

臭椿酮（體積分?jǐn)?shù)≥98%,上海誠凜生物科技有限公司）;四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）均購自美國Sigma 公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS,上?？道噬锟萍加邢薰荆?Promega試劑盒、TakaRa熒光定量試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞

前列腺癌22RV1細(xì)胞,由上海極威生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

將前列腺癌22RV1細(xì)胞接種于RPMI-1640 培養(yǎng)基（含胎牛血清）中,置于培養(yǎng)箱中,隔天換液,待細(xì)胞增殖融合貼壁生長達(dá)到80%～90%后,采用質(zhì)量濃度為1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度后傳代,選處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞分組、干預(yù)及形態(tài)學(xué)觀察

用質(zhì)量濃度為1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的前列腺癌22RV1細(xì)胞,以每孔1×105個(gè)的密度接種于96孔板,分為對照組、臭椿酮低劑量組、臭椿酮中劑量組和臭椿酮高劑量組,培養(yǎng)至細(xì)胞再次貼壁。臭椿酮低、中和高劑量組分別加入不同濃度的臭椿酮,使各孔臭椿酮終濃度分別為0.4、0.8和1.0μmol·L-1,對照組加入等量PBS,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用倒置顯微鏡（×400）觀察培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞形態(tài)變化。

2.3 各組細(xì)胞增殖情況測定

用質(zhì)量濃度為1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化傳至4～6代的前列腺癌22RV1細(xì)胞,以每孔2×103個(gè)的密度接種于96孔板,分別以終濃度為0.4、0.8和1.0μmol·L-1的臭椿酮進(jìn)行干預(yù),各濃度均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h,加入新制備的質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1的MTT 溶液,每孔20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后離心丟棄上清液,每孔加入DMSO 溶液150μL,振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解,繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后吸出上清液,采用酶標(biāo)儀測定每孔490 nm 處的吸光度（A）。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次[5]。

2.4 各組細(xì)胞凋亡率的測定

用質(zhì)量濃度為1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化各組培養(yǎng)72 h的前列腺癌22RV1細(xì)胞,用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次,重懸后以2 800 r·min-1離心10 min后丟棄上清液,用少量PBS溶液吹開并混勻沉淀,加入預(yù)冷乙醇2 mL,于4℃過夜。次日離心丟棄上清液,用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次,加入Annexin V-APC 5μL、Propidium Iodide 5μL后充分混合均勻,室溫下避光孵育10 min,過濾,用流式細(xì)胞儀對各組細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行測定。

2.5 各基因引物序列的測定

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測各組細(xì)胞AR、下游基因前列腺特異性抗原（prostate specific antigen,PSA）、FK506結(jié)合蛋白5（FK506 binding protein 5,FKBP5）、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族45A3（solute carriers 45A3,SLC45A3）、N-myc下游調(diào)節(jié)基因1（N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1）mRNA 的表達(dá)水平。收集培養(yǎng)72 h的22RV1細(xì)胞,按照Trizol說明書操作步驟提取各組細(xì)胞總RNA,經(jīng)Promega試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后獲取cDNA,對cDNA 進(jìn)行定量檢測后實(shí)施PCR 擴(kuò)增,根據(jù)TaKaRa熒光定量試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性30 s,64℃退火30 s,70℃延伸30 s,重復(fù)43個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin,目的基因相對表達(dá)強(qiáng)度為2-△△Ct,重復(fù)3次取Ct平均值。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequences of each gene

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0處理、分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示,以單因素方差分析比較多樣本資料,兩兩樣本資料比較采用Snk-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

不同濃度臭椿酮干預(yù)48 h后細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)顯著變化:對照組細(xì)胞的生長狀態(tài)旺盛,細(xì)胞之間緊密接觸、貼壁生長,且輪廓清晰、分裂相多;臭椿酮低劑量組細(xì)胞的生長被抑制,分裂相減少;臭椿酮中劑量組細(xì)胞的生長被顯著抑制,僅少數(shù)細(xì)胞貼壁生長,分裂相顯著減少,折光性弱,部分細(xì)胞死亡;臭椿酮高劑量組細(xì)胞死亡數(shù)量顯著增加,活細(xì)胞數(shù)量顯著減少。結(jié)果見圖1。

3.2 各組細(xì)胞增殖情況比較

各組24、48、72 h MTT 實(shí)驗(yàn)A值比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;臭椿酮高、中和低劑量組MTT 實(shí)驗(yàn)A值均低于對照組,臭椿酮高劑量組MTT 實(shí)驗(yàn)A值均低于臭椿酮低、中劑量組,臭椿酮中劑量組MTT 實(shí)驗(yàn)A值低于臭椿酮低劑量組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;各組MTT 實(shí)驗(yàn)A值均隨處理時(shí)間的延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)刻增殖情況比較 （,n=5）Tab.2 Comparison of cell proliferation at different times among different groups （,n=5）

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)刻增殖情況比較 （,n=5）Tab.2 Comparison of cell proliferation at different times among different groups （,n=5）

注:與對照組比較,a P＜0.05;與臭椿酮低劑量組比較,b P＜0.05;與臭椿酮中劑量組比較,c P＜0.05;與24 h比較,d P＜0.05;與48 h比較,e P＜0.05。

3.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

干預(yù)72 h后對照組及臭椿酮低、中和高劑量組細(xì)胞的凋亡率分別為2.09%±0.65%、12.86%±1.12%、39.31%±2.83%、52.63%±2.9%,細(xì)胞凋亡率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=588.546,P=0.000）;臭椿酮低、中和高劑量組凋亡率均高于對照組（q=18.597、20.923、37.291,P=0.000）,臭椿酮高劑量組高于臭椿酮低、中劑量組（q=28.099、7.273,P=0.000）,臭椿酮中劑量組高于臭椿酮低劑量組（q=19.432,P=0.000）。結(jié)果見圖2。

3.4 各組細(xì)胞AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA表達(dá)水平比較

AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA的相對表達(dá)量組間比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;臭椿酮低、中和高劑量組AR、PSA、FKBP5、SLC45A3 m RNA 的相對表達(dá)量均低于對照組,臭椿酮高劑量組低于臭椿酮中、低劑量組,臭椿酮中劑量組低于臭椿酮低劑量組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;臭椿酮低、中和高劑量組NDRG1 mRNA的相對表達(dá)量均高于對照組,臭椿酮高劑量組高于臭椿酮中、低劑量組,臭椿酮中劑量組高于臭椿酮低劑量組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組細(xì)胞AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA表達(dá)水平比較 （,n=5）Tab.3 Comparison of m RNA expression of AR,PSA,FKBP5,SLC45A3,and NDRG1 among different groups（,n=5）

表3 各組細(xì)胞AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA表達(dá)水平比較 （,n=5）Tab.3 Comparison of m RNA expression of AR,PSA,FKBP5,SLC45A3,and NDRG1 among different groups（,n=5）

注:與對照組比較,a P＜0.05;與臭椿酮低劑量組比較,b P＜0.05;與臭椿酮中劑量組比較,c P＜0.05。

4 討論

前列腺癌發(fā)病原因多樣,與年齡、家族史、肥胖、飲食、飲酒、首次遺精年齡及性生活頻率等因素均有關(guān)[6-7]。目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確,但有研究者認(rèn)為,雄激素和AR 信號的作用與前列腺癌的發(fā)生相關(guān)[8-9]。AR 是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心調(diào)控因子,其過表達(dá)和分子過度激活與該病發(fā)展的關(guān)系密切,是導(dǎo)致CRPC的重要因素,顯著影響其預(yù)后[10]。因此,臨床醫(yī)師逐漸將注意力轉(zhuǎn)向AR 靶向治療及相關(guān)藥物的研究。

本研究發(fā)現(xiàn),臭椿酮低、中和高劑量組細(xì)胞的生長受到抑制,細(xì)胞數(shù)量減少;臭椿酮低、中和高劑量組MTT 實(shí)驗(yàn)A值均低于對照組,凋亡率均高于對照組,均具有劑量依賴性,提示臭椿酮可抑制前列腺癌22RV1細(xì)胞的增殖,并促使其凋亡,且具有劑量依賴性。臭椿酮具有多種生物學(xué)活性,可抗瘧疾、抗?jié)?、抗過敏、抗微生物,且能促進(jìn)自身免疫力的提升進(jìn)而起到多種治療功效[11-12]。此外,臭椿酮可抑制由缺失配體結(jié)構(gòu)域及雙氫睪酮誘導(dǎo)的AR 活性,從而抑制前列腺癌細(xì)胞的生長。陳小宇等[13]研究發(fā)現(xiàn),臭椿酮可能通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)人黑色素瘤A375細(xì)胞的凋亡。另有研究通過反向分子對接技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)臭椿酮的靶蛋白中有11個(gè)富集于前列腺癌通路中,臭椿酮有望成為治療前列腺癌的有效藥物[14]。

本研究中臭椿酮低、中和高劑量組AR、PSA、FKBP5、SLC45A3 mRNA 的相對表達(dá)量均低于對照組,且3 組依次降低;臭椿酮低、中和高劑量組NDRG1 m RNA 的相對表達(dá)量均高于對照組,且3組依次升高,推測臭椿酮可通過調(diào)控AR 及其下游相關(guān)基因的表達(dá),從而調(diào)控前列腺癌22RV1細(xì)胞的增殖和凋亡。PSA 為人組織型激肽釋放酶家族成員,與雄激素結(jié)合后可激活A(yù)R 和PSA 蛋白的表達(dá),經(jīng)前列腺上皮細(xì)胞釋放入血[15-16]。有文獻(xiàn)指出[17],AR 正調(diào)控PSA 的同時(shí)可被PSA 反饋激活,進(jìn)而調(diào)控AR的表達(dá)。FKBP5屬于親免素蛋白家族成員,其實(shí)質(zhì)為雄激素調(diào)節(jié)基因,在AR 信號通路中扮演著重要角色。SLC45A3為前列腺癌特異性雄激素應(yīng)答基因,經(jīng)前列腺癌患者雄激素R1881誘導(dǎo),其處于異常高表達(dá)狀態(tài)[18]。NDRG1是N-myc下游調(diào)節(jié)基因,異常低表達(dá)于乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中,研究發(fā)現(xiàn)其可作為腫瘤抑制因子參與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移的調(diào)控[19-20]。臭椿酮可阻斷AR 結(jié)合其分子伴侶復(fù)合體,降低AR 蛋白穩(wěn)定性進(jìn)而被蛋白酶體降解,從而顯著下調(diào)AR 并削弱其轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而調(diào)控其下游基因PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1的表達(dá),發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

綜上所述,臭椿酮可促使前列腺癌22RV1細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,抑制其增殖,促使其凋亡,且表現(xiàn)為劑量依賴性,推測該藥物可能通過下調(diào)內(nèi)源性AR 及其下游基因PSA、FKBP5、SLC45A3 m RNA 的表達(dá),上調(diào)NDRG1 m RNA 的表達(dá)發(fā)揮抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用。