楊杰 陳蓉 胡文娟 吳巧玲 佟曉楠 李興濤 陳健美

摘要：Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運（Na+/H+exchange or antiporter，NHX）蛋白家族的氨基酸序列具有Na+/H+exchange 蛋白結(jié)構(gòu)域，在植物生長發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。為探究甜橙（ Citrus sinensis ） NHX 基因家族的生物學(xué)特性，本研究從甜橙基因組中鑒定出6個 NHX 基因家族成員，并對其理化性質(zhì)、基序組成、進化關(guān)系、表達譜等進行分析。結(jié)果顯示， CsNHXs 編碼蛋白的長度為407～543個氨基酸，分子量為44.71～59.97 ku;所有 CsNHXs 非均勻地分布在5條染色體上，均具有保守的Na+/H+exchange結(jié)構(gòu)域;蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，甜橙NHX蛋白主要以 α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。與擬南芥（ Arabidopsis thaliana ）、水稻（ Oryza sativa ）的NHX蛋白一起構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹聚類為3個亞群，甜橙NHX蛋白分布在Endo和Vac亞群中。順式作用元件預(yù)測分析結(jié)果表明， CsNHXs 啟動子區(qū)域包含多個植物的生長發(fā)育響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明， CsNHXs 在甜橙不同組織中的表達存在差異性，總體上分為特異性表達和普遍性表達。本研究系統(tǒng)分析了甜橙 NHX 基因家族，為進一步闡明甜橙 NHX 基因家族的功能提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甜橙; NHX 基因家族;生物信息學(xué);基因表達;順式作用元件

中圖分類號：S666.401 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0035-08

收稿日期：2021-10-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：32060667、32160731）;江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（編號：GJJ190758、GJJ180758）。

作者簡介：楊 杰（1995—），男，山西呂梁人，碩士研究生，主要從事果樹逆境生理研究。E-mail：yangjiepersist@qq.com。

通信作者：陳健美，博士，副教授，主要從事柑橘遺傳育種研究。E-mail：chen_jm09@hotmail.com。

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運（Na+/H+exchange or antiporter，NHX）蛋白屬于陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運體1（cation/proton antiporter-1，CPA1）超家族，具有保守的Na+/H+exchange 結(jié)構(gòu)域[1]。NHX蛋白能將細胞內(nèi)Na+排除或區(qū)隔化來保持植物細胞內(nèi)較低水平的Na+濃度[2]，具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值、控制細胞擴增和維持細胞膨壓的功能，是響應(yīng)植物抗旱耐鹽機制的關(guān)鍵因子[3]。

NHX 基因廣泛存在于植物中，現(xiàn)已在擬南芥[4]、水稻[5]、玉米[6]、蘋果[7]、香蕉[8]等植物中發(fā)現(xiàn)了該基因家族蛋白。其中，部分 NHX 基因的功能也已經(jīng)被驗證。過表達AtNHX1的擬南芥株可以在200 mmol/L NaCl溶液中持續(xù)生長和發(fā)育[9];將水稻OsNHX1超表達，可以提高轉(zhuǎn)基因水稻株的耐鹽性[5];過表達SsNHX1的轉(zhuǎn)基因玉米株在10 mg/mL NaCl溶液中有較高的種子發(fā)芽率和較小的生理損傷[10];劉威等通過施加10%聚乙二醇（PEG）6000、100 mmol/L脫落酸（ABA）提高了杜梨葉片中PbNHX1的轉(zhuǎn)錄水平[11];另外Bao等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將霸王ZxNHX1轉(zhuǎn)入百脈根后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的葉片和根中積累了比對照更多的Na+、K+和Ca2+，保持了其葉片較低滲透勢和較高的保水率，顯著提高了轉(zhuǎn)基因株系的抗旱性[12]。

甜橙（ Citrus sinensis ）為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（ Citrus ）多年生果樹，主要分布于16°～37°N，甜橙也是市場上暢銷鮮果之一，我國是甜橙產(chǎn)量增長最快的國家[13-14]。 NHX 基因雖然已在多種植物中都有研究，但在甜橙中還未見關(guān)于 NHX 基因家族成員的報道。甜橙基因組數(shù)據(jù)的公布，使研究甜橙 NHX 基因家族成員成為了可能。本研究以甜橙為研究對象，在全基因組水平上鑒定出6個甜橙 NHX 基因家族成員，并進一步分析其理化性質(zhì)、進化關(guān)系和表達水平等，以期為后續(xù)深入研究甜橙 NHX 基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甜橙 NHX 基因家族鑒定

甜橙基因組數(shù)據(jù)來源于CPBD（http：//citrus.hzau.edu.cn/index.php），含有Na+/H+exchange結(jié)構(gòu)域的HMM模型（PF00999）來自于Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）。利用HMMER 3.0軟件在甜橙基因組數(shù)據(jù)中進行比對分析，比對結(jié)果經(jīng)Pfam、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/term）和InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）數(shù)據(jù)庫進行驗證，去除不含Na+/H+exchange保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，得到的甜橙 NHX 基因家族成員（ CsNHXs ）按照其在染色體上的位置依次進行命名。

1.2 甜橙 NHX 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy ProtParam軟件（http：//web.expasy.org/compute_pi/）在線分析甜橙NHX蛋白序列長度、相對分子量、理論等電點、親水性等理化性質(zhì);采用WoLF PSORT（https：//psort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預(yù)測分析。

1.3 甜橙 NHX 基因家族成員的染色體定位及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

從CPBD獲取甜橙基因組注釋文件，確定 CsNHXs 的位置信息和染色體長度信息，利用Map MG2C工具（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）在線繪制 CsNHXs 在染色體上的位置分布圖。

經(jīng)查閱文獻，分別得到8個擬南芥（ Arabidopsis thaliana ） NHX 基因序列號、7個水稻（ Oryza sativa ） NHX 基因序列號，參照前人的命名規(guī)則[15]對其命名。然后采用MEGA 7.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000，其他參數(shù)為默認值。

1.4 甜橙 NHX 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

使用GSDS v2.0軟件（http：//gsds.gao-lab.org/）在線對 CsNHXs 的基因結(jié)構(gòu)進行可視化分析;利用MEME在線網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/）對 CsNHXs 編碼的蛋白質(zhì)進行模體（motif）分析，數(shù)量設(shè)置為10;通過Pfam數(shù)據(jù)庫在線分析 CsNHXs 編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 甜橙 NHX 基因編碼蛋白的空間結(jié)構(gòu)

甜橙NHX蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測運用軟件SPOMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線分析完成;通過SWISS-MODEL在線分析工具（https：//swissmodel.expasy.org/），采用同源建模（以序列相似度高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為模板）的方法預(yù)測分析甜橙NHX蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.6 甜橙 NHX 基因家族成員的共線性分析

利用TB-tools分析 CsNHXs 在進化過程中可能發(fā)生的基因復(fù)制事件，并篩選重復(fù)基因?qū)π畔?根據(jù)蛋白序列的相似性，通過TB-tools繪制甜橙和枳（ Poncirus trifoliata）NHX 基因的共線性關(guān)系圖。

1.7 甜橙 NHX 基因家族成員的啟動子順式作用元件分析

使用Plant CARE軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測 CsNHXs 起始密碼子上游2 000 bp區(qū)域的順式作用元件，并將順式作用元件按照功能歸類后通過 TB-tools 可視化。

1.8 甜橙 NHX 基因家族成員的表達分析

在CPBD數(shù)據(jù)庫中下載甜橙愈傷組織、花、葉片和果實中的RNA-seq數(shù)據(jù)，分析 CsNHXs 在4個不同組織中的相對表達量。使用TB-tools將結(jié)果可視化，紅色表示基因表達量上調(diào)，綠色則表示下調(diào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜橙 NHX 基因家族成員的鑒定與分析

由表1可知，在甜橙基因組中共鑒定到6個 CsNHXs ，根據(jù)染色體定位依次命名為CsNHX1～CsNHX6。 CsNHXs 的蛋白序列差異較小，長度（以氨基酸數(shù)量計）為407～543個，蛋白質(zhì)分子量為4471～59.97 ku。理論等電點（pI）介于5.16～894之間，其中CsNHX2和CsNHX6等電點大于7，為堿性蛋白;其余家族成員的等電點小于7，為酸性蛋白。蛋白親水性平均系數(shù)為0.443～0566，均大于0，為疏水性蛋白。CsNHX1、CsNHX3和CsNHX4蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，預(yù)測為不穩(wěn)定蛋白;其他成員的小于40，為穩(wěn)定蛋白。蛋白脂肪系數(shù)為101.97～112.60，平均值為109.59，均具有較高的脂肪系數(shù)。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，除CsNHX3定位在液泡，其他所有CsNHX蛋白都定位在質(zhì)膜。

2.2 甜橙 NHX 基因家族成員的染色體定位分析

如圖1所示，6個 CsNHXs 分別分布在5條染色體上。CsNHX1位于第2條染色體上，CsNHX2、CsNHX3位于第3條染色體上，CsNHX4位于第4條染色體上，CsNHX5位于第5條染色體上，CsNHX6位于第9條染色體上。總的來看，染色體的長度與其上分布的 CsNHXs 數(shù)量無正相關(guān)關(guān)系。

2.3 甜橙 NHX 基因家族成員的進化分析

采用Neighbor-Joining法構(gòu)建擬南芥、水稻和甜橙共21個NHX蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）顯示，供試 NHX 基因家族可以分為3個亞群，而甜橙 NHX 基因家族分為2個亞群。其中甜橙 NHX 基因家族成員主要集中于Vac亞群中，包括CsNHX2、CsNHX3、CsNHX4、CsNHX5和CsNHX6，而Endo亞群僅含CsNHX1。此外，PM亞群由擬南芥和水稻 NHX 基因所構(gòu)成。

2.4 甜橙 NHX 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析

分析6個甜橙 NHX 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)，包括外顯子、上下游序列及內(nèi)含子。結(jié)果（圖3）顯示，6個 CsNHXs 均含有外顯子，但各基因外顯子數(shù)量存在差異。其中CsNHX1的外顯子數(shù)量最多，達20個;CsNHX2、CsNHX4、CsNHX5和CsNHX6中均含14個外顯子;CsNHX3最少，僅含10個。除CsNHX1和CsNHX3外，其余4個 CsNHXs 均含有上游基因序列。甜橙 NHX 基因家族成員分為2個亞群，且在進化樹中位置相近的 CsNHXs 具有類似的基因結(jié)構(gòu)。

2.5 甜橙 NHX 基因家族成員的保守基序分析

為進一步研究甜橙 NHX 基因家族成員結(jié)構(gòu)特征，對6個 CsNHXs 的保守基序進行分析，得到10個保守motif（圖4），其中motif的具體基序如圖5所示。分析結(jié)果表明，不同 CsNHXs 的motif數(shù)量相差較大，為4～10個;所有 CsNHXs 均含有motif 1和motif 2，證明motif 1和motif 2基序高度保守，其中motif 2基序中包含F(xiàn)FI/LY/FLLPPI結(jié)合位點，代表Na+/H+exchange結(jié)構(gòu)域;同一亞群 CsNHXs 間motif的數(shù)量、類型和空間分布相似，如motif 2、motif 4、motif 5、motif 6、motif 9和motif 10;CsNHX3中的Motif數(shù)量相比同一進化分支其他基因有缺失，這可能是基因串聯(lián)重復(fù)過程中堿基丟失造成的;N端主要是motif 6，該基序保守結(jié)構(gòu)可能與順式作用元件結(jié)合。對CsNHX蛋白序列的結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn)，所有CsNHX蛋白均含有Na+/H+exchange保守結(jié)構(gòu)域（圖6）。

2.6 甜橙NHX蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

甜橙NHX蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（表2）表明，6個CsNHX蛋白的二級結(jié)構(gòu)均有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲。其中α-螺旋所占比例為4317%～50.38%，是甜橙NHX蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成部分;β-折疊和無規(guī)則卷曲所占比例較少，分別為360%～4.43%和29.73%～34.50%。用SWISS-MODEL在線分析CsNHX蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖7）表明6個CsNHX蛋白之間的相似性在 27.46%～36.81%之間。

2.7 甜橙 NHX 基因家族成員的共線性分析

為了確定甜橙 NHX 基因家族成員的復(fù)制事件，對甜橙基因組進行共線性分析。結(jié)果（圖8-A）表明，CsNHX5和CsNHX6之間存在共線性關(guān)系。為進一步闡明 NHX 基因在甜橙和枳之間的進化關(guān)系，對這2個物種進行共線性分析。如圖8-B所示，在甜橙和枳之間共鑒定出7個直系同源基因?qū)?，分別為CsNHX1/Pt2g02470.1、CsNHX2/Pt5g016100.1、CsNHX3/Pt5g013790.1、CsNHX4/Pt1g015450.1、CsNHX5/Pt9g003290.1、CsNHX6/Pt9g003290.1和CsNHX6/Pt3g033270.1。

2.8 甜橙 NHX 基因家族成員的啟動子順式作用元件分析

在 CsNHXs 上游2 000 bp啟動子區(qū)域的順式作用元件類型主要分為3種：植物生長發(fā)育響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、逆境響應(yīng)元件（圖9）。其中，參與植物生長發(fā)育的響應(yīng)元件G-Box（30個）和Box 4（19個），存在于所有 CsNHXs 中。激素響應(yīng)元件在 CsNHXs 中預(yù)測到8種，分布最廣的脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）數(shù)量最多（26個）;其次是乙烯響應(yīng)元件（ERE），數(shù)量為9個;而茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif，CGTCA-motif）數(shù)量均為8個。逆境響應(yīng)元件中，參與干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點（MBS）和非生物脅迫（W box）的元件數(shù)量均為6個，參與應(yīng)激反應(yīng)（TC-rich repeats）和厭氧誘導(dǎo)（ARE）的元件數(shù)量均為5個。這些結(jié)果表明， CsNHXs 在甜橙生長發(fā)育、激素誘導(dǎo)和響應(yīng)非生物脅迫的過程中可能發(fā)揮重要作用。

2.9 甜橙 NHX 基因家族成員的表達分析

6個 CsNHXs 的表達模式結(jié)果表明， CsNHXs 在不同組織中均有不同程度的表達（圖10）。其中，愈傷組織中表達量高的基因有CsNHX1、CsNHX2、CsNHX4和CsNHX6;花中表達量高的基因有CsNHX1和CsNHX2; 葉片中表達量高的基因為CsNHX2; 果實中表達量高的基因有CsNHX1、CsNHX2和CsNHX4。表明CsNHXs在甜橙中具有組織表達特異性。此外，CsNHX1和CsNHX2在不同組織中表達量均較高，而CsNHX3和CsNHX5表達量均較低。

3 討論與結(jié)論

NHX蛋白主要參與植物響應(yīng)鹽脅迫過程中離子平衡的重建[16-17]，但對具有較高經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值的甜橙中 NHX 基因家族知之甚少。因此，對甜橙 NHX 基因家族的鑒定分析，有助于了解 CsNHXs 的結(jié)構(gòu)和潛在功能。

本研究基于甜橙基因組數(shù)據(jù)共鑒定出6個 CsNHXs ，比擬南芥少2個，比水稻少1個，比番茄多1個[18]，說明不同物種間 NHX 基因家族成員數(shù)量存在差異。甜橙 NHX 基因家族成員間內(nèi)含子-外顯子分析結(jié)果差異較大， CsNXHs 內(nèi)含子數(shù)量在9～19個，其中67%的 CsNHXs 含13個內(nèi)含子;而外顯子數(shù)量為10～20個。這與前人在葡萄[1]和石榴[19]中的研究結(jié)果相類似，證明 NHX 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)在不同物種中比較保守。6個 CsNHXs 編碼的蛋白均含Na+/H+exchange結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)上高度保守，這與王影等對杜梨 NHX 基因家族的研究結(jié)果[20]一致。此外，4個CsNHX蛋白為酸性蛋白，推測 CsNHXs 主要在酸性亞細胞環(huán)境中發(fā)揮作用。

Wu等在甜菜 NHX 基因家族研究中將甜菜、擬南芥、水稻等13種植物共93個NHX蛋白的進化樹聚成3個亞群：Vac、Endo和PM[15]。本研究中甜橙、擬南芥和水稻NHX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹同樣分為Vac、Endo和PM共3個亞群， AtNHXs和OsNHXs 不均勻地存在于3個亞群中，而 CsNHXs 存在于除PM外的亞群中。相對單子葉植物水稻而言，甜橙與雙子葉植物擬南芥 NHX 基因親緣關(guān)系更近，同源性較高，說明 CsNHXs 在進化上較為保守。此外，具有相似Motif組成的甜橙 NHX 基因家族成員，在聚類分析中距離較近，暗示進化方式相近的 NHX 基因的蛋白結(jié)構(gòu)和功能也相近。

6個 CsNHXs 啟動子區(qū)含有多種激素類響應(yīng)元件，且不同基因間元件數(shù)量和種類均有差異，說明 CsNHXs 響應(yīng)激素的種類和程度不同，進而導(dǎo)致 CsNHXs間功能有差異;部分CsNHXs還同時含有多種逆境響應(yīng)元件，證明CsNHXs 作為中間轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)不同激素的信號，從而調(diào)節(jié)植株在逆境脅迫中的生長。羅建等對辣椒 NHX 基因啟動子序列順式作用元件的分析[21]與本研究的結(jié)果相似。此外， CsNHXs 在不同組織中表達的分析結(jié)果進一步表明，該基因家族在甜橙不同組織中存在表達差異，推測 CsNHXs 在甜橙愈傷組織、花、葉片和果實各自發(fā)育過程中發(fā)揮著一定的調(diào)控作用，但具體功能機制需要在后續(xù)試驗中進一步驗證。

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